禽白血病的研究現狀

葛 成，張海龍，陳 玥，焦賀靜，李蘊玉，李佩國，張志強，張香齋

(河北科技師范學院河北省預防獸醫學重點實驗室，河北 秦皇島，066600)

禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的對家禽危害較大的一種以垂直及水平傳播的腫瘤性疾病。病毒分類委員會報告，ALV類屬于反轉錄病毒科、正反轉錄病毒亞科、甲型反轉錄病毒屬[1～3]。AL在我國被列為二類動物疫病，國務院發布《國家中長期動物疫病防治規劃(2012～2020年)》將其列為養禽業必須凈化的疫病之一[4,5]。為盡早達到國家對AL凈化的要求，從理論上指導各養殖場防控該病，為此展開綜述。

1 病原學

1.1 ALV的分類

按照病毒囊膜糖蛋白抗原特異性、病毒干擾試驗及宿主范圍將ALV分為A～K 11個亞群[6,7]，從雞群分離到的有A～E，J，K亞群，其中E亞群為內源性病毒，致病性弱或無致病性，其余為外源性病毒，以J亞群傳染性及致病力最強[8]。J亞群是由Payne等[9]于1988年首次從商品代肉用雞中分離。1999年J亞群首次在我國商品代肉雞中檢測發現[10]。目前，J亞群在我國各個品種雞群中均有存在。ALV在臨床上可導致雞發生淋巴細胞性AL，成紅細胞性AL，成髓細胞AL，髓細胞樣AL[11,12]。研究表明，J亞群是由外源性ALV和內源性ALV重組而成，主要引起傳染性致骨髓細胞瘤疾病或成髓性白血病[8]。

1.2 ALV的結構特征

ALV是反轉錄病毒，具有脂質囊膜，病毒粒子為20面體對稱性的近似球形結構[13]。病毒粒子從外到內分為3層結構，外層是來自于宿主細胞膜的類脂質囊膜，在其表面分布有特征性的放射狀突起即纖突，直徑約8 nm；其中間層即為病毒的內膜，是一種20面體衣殼，直徑約為60 nm；最內層是致密的核心，直徑為35～45 nm，核心結構的組成成分由二倍體 RNA 和核衣殼、反轉錄酶、整合酶、蛋白酶組成[14]。

1.3 ALV的理化特性

ALV對外界環境抵抗力較弱，對脂溶性溶劑、去污劑和甲醛敏感，但對紫外線有一定的抵抗力[15]。pH值在4.5～9.0保持穩定，不耐高溫，溫度在60 ℃時 42 s 失活，溫度在56 ℃時30 min 失活；溫度在37 ℃時下半衰期為100～540 min，平均為260 min。因此，熱不穩定性成為保存病毒最重要的因素。當溫度低于-60 ℃以下時，ALV可保存幾年而不降低感染力，反復凍融亦可使病毒裂解釋放群特異性抗原p27，進而變于ALV的檢測。

1.4 ALV基因組

ALV基因組是二聚體結構，由單股、正鏈、線性RNA等3種結構組成，全長約為7.2～7.8 kb。RNA存在于病毒粒子中，但并不具有感染性，兩分子的RNA在各自的5′端由氫鍵相連。除此之外，基因組RNA的一分子還與來自特異宿主的一分子tRNA相連，在反轉錄過程中病毒RNA生成DNA的引物。病毒基因組RNA單體結構在反轉錄過程中類似于真核細胞的mRNA，5′端為甲基化的帽子結構，3′端為 ploy(A)[1，2]。

1.5 ALV蛋白結構

ALV編碼區主要編碼Gag，Pol及Env蛋白，分別為病毒群特異性和蛋白酶、反轉錄酶及囊膜糖蛋白[16]。

1.5.1Gag基因編碼的蛋白Gag基因長約2 100 bp，核苷酸序列高度保守，非糖基化結構蛋白是ALV內部編碼的主要基因之一，由其編碼的蛋白主要分為基質蛋白(MA)p19，p10蛋白，衣殼蛋白(CA)p27，核衣殼蛋白(NC)pl4及酶蛋白中的蛋白酶(Pro)p15，其中p19主要起連接作用，p10和早期感染及后期病毒裝配相關[17]，主要維持病毒粒子的近球形結構。病毒的重要核心組成為p27，它是主要的群特異性抗原，不同亞群之間核苷酸序列高度保守，以此利用ELISA檢查ALV的抗原位點。p14與基因組RNA密切結合，主要負責RNA的加工和包裝，p15主要對蛋白的前體進行剪切，參與Gag和Pol前體蛋白的水解過程，從而生成成熟蛋白質，組合病毒粒子。

1.5.2Pol基因編碼的蛋白Pol基因長約2 600 bp，其內部的核苷酸序列非常保守，編碼的主要有反轉錄酶(RT)p68和整合酶(IN)p32[18]，p68和p32主要作用是介導ALV的cDNA基因組整合進宿主，這一步驟是反轉錄病毒復制進程中的關鍵環節，進而使Pol基因在ALV侵染宿主細胞中發揮了重要作用。

1.5.3Env基因編碼的蛋白Env基因主要對2種囊膜基因糖蛋白進行編碼，即囊膜糖蛋白gp85和跨膜糖蛋白gp37[19]。Env基因主要與病毒的抗原性、致瘤類型及宿主范圍密切相關，是致瘤的關鍵基因，不同亞群之間Env基因核苷酸序列差異很大，其中J亞群Env基因與其他亞群核苷酸序列同源性僅為40%左右，而其他亞群間核苷酸序列同源性可達80%～85%。進而說明，在J亞群Env基因中存在J亞群特異性表位抗原[20]。

ALV gp85中有5個重要區域，2個高變區hr1和hr2，是主要的受體相互作用區域[21,22]，3個可變區vr1，vr2和vr3，vr3在決定受體識別的特異性中發揮作用[23]。ALV各亞群間群特異性由2個高變區和1個可變區(vr3)決定，不同ALV毒株間差異性取決于該3區的變化。研究發現，ALV的hr1，hr2和vr3中，以hr1和hr2區核苷酸序列變化明顯，親水性較好的為hr1和hr2，這種親水性主要體現為hr2擁有特征性的彎曲回旋結構[24]。進一步研究發現，J亞群hr2區在病毒與宿主細胞膜表面受體結合時發揮了主要作用，J亞群Env基因呈現高度變異的是hr1和vr3區，和其他亞群相比，在很大范圍內可能有利于J亞群ALV較好地避開宿主的天然免疫[25]。gp85基因中擁有病毒受體決定簇，而且能夠誘導宿主產生中和抗體，病毒亞群特異性也由其決定，其序列的高度突變可使宿主范圍改變，因此，使ALV得以擁有跨種傳播的潛力[26,27]。

ALV gp37中有3個功能區，為胞外區、跨膜區和胞內區，能夠與gp85相結合的結合區分布于胞外區，胞外區具有超螺旋結構，能夠介導病毒與細胞膜進行融合。當gp85與宿主細胞受體進行結合，便會啟動跨膜蛋白一系列結構變化，使病毒囊膜與宿主細胞膜拉近，進而釋放能量使病毒囊膜與宿主細胞膜融合，由此病毒粒子釋放到宿主細胞。

2 流行病學

2.1 宿主范圍

依據ALV宿主特異性是由囊膜糖蛋白決定的這一特性，從目前的研究中發現，雞是ALV的自然宿主，宿主范圍包括雉雞、鴿、鷓鴣等一些野鳥類[28～31]。研究ALV持續帶毒理想的試驗動物為鴨，給鴨胚接種ALV，其病毒可在鴨胚中存活3年且不出現中和抗體及病毒血癥。

2.2 傳播途徑與傳染源

ALV主要通過垂直和水平兩種方式進行傳播，其中以垂直傳播為主[32]。ALV在傳播過程中，傳染源主要為病雞、帶毒雞和被感染的種蛋，而起至關重要作用的是帶毒雞。病毒繁殖存在于帶毒母雞的整個生殖系統當中，病毒濃度最高的部位為輸卵管，特別是蛋白分泌部，因此產出帶毒雞蛋，孵出的雛雞也攜帶有病毒。這種先天性感染的雛雞常有免疫耐受現象，其不產生抗腫瘤病毒抗體，長期帶毒排毒，成為重要傳染源。雞群感染ALV后，存在4種血清類型，即無病毒血癥，有抗體；無病毒血癥，無抗體；有病毒血癥，無抗體；有病毒血癥，有抗體。

3 臨床癥狀及病理變化

感染ALV的雞群主要表現生長遲緩、高死亡率、免疫抑制及腫瘤多樣性，所感染毒株的不同，所呈現出來的臨床癥狀和病理變化也不一樣，其中最為常見是淋巴細胞性AL，成年雞易感，產蛋前期發病率較高[18,25]。病雞表現食欲不振，精神萎靡，雞冠蒼白，消瘦，排灰白色稀糞，腹部膨大。剖檢可見，心、肝、脾實質性器官出現大小不一的腫瘤，呈彌漫性或結節形，肝臟腫大。成紅細胞性AL是較少見的一種類型，臨床上可見的類型有成紅細胞大量增生型和血液中只含有少量的未成熟的細胞貧血型，成紅細胞增生型在臨床當中較為常見。病雞表現雞冠蒼白、消瘦、腹瀉、精神不振、全身性貧血。剖檢可見，增生型肝、脾、腎等臟器出現腫瘤結節且呈櫻桃紅色或暗紅色彌漫性腫大。貧血型則表現為內臟萎縮，其中以脾臟萎縮最為嚴重。對病理組織進行切片鏡檢可見，大量的成紅細胞在骨髓和肝臟的竇狀隙及毛細血管內積聚。成髓細胞AL是較少發生的一種類型，主要見于成年雞。臨床可見雞只貧血，消瘦，毛囊出血等。剖檢可見病雞心、肝、脾等實質性器官呈現灰白色彌漫性腫瘤結節。髓細胞樣AL是極少見的一種類型。臨床上可見精神低迷，食欲不佳，消瘦，貧血。病理組織切片鏡下觀察可見骨髓細胞特異性生長。

4 診 斷

AL可依據流行病學及臨床癥狀和病理變化進行初步判斷，但確診需進行實驗室檢測，主要包括病毒的分離鑒定、聚合酶鏈式反應技術、酶聯免疫吸附試驗、免疫熒光技術、快速檢測試紙條、核酸斑點雜交試驗等[32]。

4.1 病毒分離鑒定

ALV的分離與鑒定被認為是最可靠的診斷方法。ALV的分離常選擇的樣品為全血、血漿、血清、雞體多種軟組織及10～11日齡雞胚等[33,34]。病毒的分離一般通過DF-1細胞或CEF細胞進行，進而利用特異性單克隆抗體接種細胞進行間接免疫熒光試驗進行ALV毒株的分離鑒定[35]。

4.2 PCR技術

PCR技術的特點是靈敏度高，為此，在病原鑒定、流行病學調查等一系列生命科學領域的研究中廣泛使用。在ALV鑒別診斷上，Kim Y等[36]于2012年將反轉錄聚合酶鏈反應半定量(QC-RT-PCR)方法應用到 ALV-J 的實時檢測中。

4.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)

ELISA是在臨床上應用較普遍的檢測方法。其原理是將群特異性抗原血清中的抗體利用熒光標記處理或酶處理，制作成熒光抗體或酶標抗體檢測群特異性抗原。1979年，英美等國相繼報道了利用ELISA方法檢測ALV，我國于1991年起開展了雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗檢測ALV[37]。當前，市場上有許多針對ALVp27抗原及ALV-A,B,J抗體檢測的ELISA試劑盒，不同廠商間的試劑盒靈敏度和特異性存在差異。在凈化進程中，由于p27抗原是ALV所有群均具有的，不區分內源性病毒和外源性病毒，所以，直接對胎糞、蛋清等樣品進行ALV p27抗原的檢測，檢測結果容易出現假陽性。因此，結合病毒分離鑒定更為可靠有效。

4.4 間接免疫熒光技術

2001年，秦愛建等[35]通過制備ALV-J特異性單克隆抗體建立了免疫熒光檢測ALV-J抗原和抗體的方法，且能夠保證檢測方法均具有高度特異性。應用免疫熒光技術適用于樣品數量較少時，進而代替ELISA，降低檢測成本，提高檢測準確度。免疫熒光技術在檢測ALV疑似病例及雞體器官腫瘤方面起到了重大作用。

4.5 快速檢測試紙條

快速檢測試紙條是采用膠體金免疫層析技術以硝酸纖維膜為固相載體，其中的示蹤標記為膠體金，使得抗原與抗體能夠形成免疫復合物從而顯色的一種檢測技術。崔賀等[38]通過對比試驗發現，膠體金試紙條的檢出率遠低于ELISA試劑盒檢出率，目前膠體金試紙條還無法完全替代ELISA檢測試劑盒。

4.6 核酸斑點雜交試驗

核酸斑點雜交試驗是將獲得的DNA點于尼龍膜上變性固定，最后與用地高辛標記的探針對ALV各個亞群的特異性探針雜交，通過是否著色進行檢測樣品當中的病毒基因序列，進而判斷是否感染ALV[24,26]。該方法不僅區分外源性病毒和內源性病毒，還可以區分A，B和J亞群。其利用的是特異性核酸探針交叉斑點試驗具有方法簡便快速、特異、靈敏、結果直觀等特點，在診斷ALV中具有重要意義。

目前，確診雞群中是否感染ALV的常用的方法主要是PCR技術，ELISA，間接免疫熒光技術等。

5 防 控

5.1 加強檢疫，控制垂直傳播

目前，對ALV還沒有合適的疫苗和有效的藥物可用來對抗，因此，只有早期檢測及嚴格淘汰種雞，經過持久地凈化從而達到種群純凈的目的[39,40]。國際凈化AL的金標準是對核心雞群在68日和168日齡分2次全部采用血漿接種DF-1細胞，培養9 d后檢測p27抗原，陽性淘汰，對于留種的下一代進行1日齡胎糞檢測，淘汰同一家系的陽性雞，如此反復進行。世界上各大型種禽場對ALV已基本達到凈化標準。然而，我國基于的現狀是養殖場數量多、分散，尤其自繁自養的地方雞種群ALV感染問題相當嚴峻。在面對我國基本國情及雞群品種復雜的條件下，我國也制定了適用于原種雞場AL凈化體系，形成了國家標準《原種雞群禽白血病凈化檢測規程》，各地方在國家標準的前提下，制定了適合本地區的凈化方案，許多種雞場也在積極開展地方品種雞和培育的黃羽肉雞、蛋用型雞的AL凈化工作，并取得了一定成效，如張桂枝等[41]報道，河南省某地方品種核心雞群經過2個世代的ALV凈化，其ALVp27 抗原陽性率由20.06%下降到4.73%，ALV分離陽性率由13.04%降低到2.17%。張銳等[42]采用隨機效應模型分析了全國297個規模養雞場疫病凈化對其后代繁育的影響，結果顯示，與未凈化雞場比較，已凈化雞場的日最高產蛋率、種蛋合格率、種蛋受精率、受精蛋孵化率分別比提高了1.091%，1.090%，0.892%，0.528%。

5.2 加強飼養管理，控制水平傳播

除了控制好垂直傳播，AL的水平傳播也不可忽視。根據ALV感染的機率及結合AL的特點，水平傳播主要發生在孵化期間和出雛后的前兩周內，在出雛廳的雌雄鑒別、免疫及苗箱之內雛雞啄食胎糞等機率都會增加。因此，控制水平傳播關鍵是控制好孵化、出雛、生產和免疫等環節。對原種雞群應采取單家系入孵與出雛，并按家系單籠飼養，雞籠間加紙板阻隔，實現籠與籠之間“只聞雞鳴，不見雞面”，避免直接接觸。所用疫苗應嚴格檢測，堅持應用安全高效的生物制品，杜絕禽白血病病原感染，不同家系的免疫應更換針頭，避免注射器傳播。

5.3 加強抗病育種研究，培育抗AL的種雞群

從長遠看，通過抗AL的育種研究，提高雞對ALV的抗性，才能從根本上控制AL的發生。目前，研究確定tva，tvb，tvc和tvj4個常染色體基因分別控制A，B，C，D，E，和J亞群的易感性[43]。通過探索各亞群受體基因遺傳多樣性情況，進而培育出具有抗AL的雞群。

6 展 望

AL是嚴重危害家禽生產的重要種源性疫病。目前，對AL還沒有合適的疫苗和有效的藥物加以對抗，現階段控制ALV最有效的途徑就是凈化。因此，探索一條既科學又經濟實用的凈化程序以及研發抗禽白血病的藥物、核酸疫苗和AL抗病育種遺傳資源的開發將是今后研究方向。