野生菌株特征功能基因過表達在食品領域中的研究進展

申 可，王曉丹*，周鴻翔，邱樹毅，班世棟，羅小葉

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽550025；2.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽550025）

野生菌株是指從自然界分離到的微生物的原始菌株，其種類繁多，具備許多特征功能，如地衣芽孢桿菌擁有較強的抑菌能力[1]，蘇云金芽孢桿菌對節肢動物具有毒殺活性[2]，假絲酵母具有較強的產脂肪酶能力[3]。早期，科研者對于野生菌株的研究僅限于功能菌株篩選、菌種鑒定及培育發酵等。20世紀以來，隨著分子生物技術的快速發展，基因工程被引入功能菌的構建，而基因過表達技術便是利用基因工程進行代謝改造的重要手段之一。

基因過表達技術是將含有目的基因的編碼區拼接至相應的載體中，上調表達目的基因，使目的基因被過度轉錄、翻譯，從而提高目標蛋白或目標代謝產物的產量的一門技術[4]，具有效率高、易操作、專一性強等特點[5]。將改造的功能菌投入食品行業，對于延長食品的保藏期，改善和增強食品的色、香、味及提高食品發酵效率等具有重要價值[6]。從發展戰略來看，挖掘潛力之大，確有廣闊的產業化開發前景。

1 基因過表達在食品領域中的研究

食品發酵過程難以控制，多菌系發酵體系還會造成菌種間的拮抗作用，生成代謝副產物，外加一些菌株的功能基因表達水平低、耐受性差等問題，都在一定程度上限制著食品企業的發展[7]。基因過表達技術的出現無疑為解決上述問題提供了突破性的思路和強有力的手段。微生物擁有豐富的酶資源，對酶資源的開發和利用尤為重要。利用該技術提高酶活性，可為食品行業提供性能優良的工程菌。縱觀大量研究報道發現，基因過表達技術在食品工業中的應用主要表現在增加目標產物產量、增強野生菌株適應環境能力等方面。

1.1 增加目標產物產量

如今，防腐劑、著色劑、食用香料等食品添加劑已活躍于各類食品加工場所，大大促進了食品工業的發展，現代食品產業對其需求量也日愈增加。然而近年來發生的一些食品安全事故都與食品添加劑有關，導致人們對食品添加劑的安全性關注度逐漸提高[8]。利用生物工程技術制備天然綠色食品添加劑已成為現今的研究方向，這不僅能夠解決資源短缺問題，也符合當前的消費潮流，引導食品產業升級[9]。

1.1.1 食品防腐劑

在食品防腐劑方面，乳酸鏈球菌素（nisin）是一種常見的具有較強殺菌能力的天然食品防腐劑，由乳酸鏈球菌發酵提取而得，在英國用于食品防腐已有50多年的歷史，常用于乳制品、肉制品、罐頭食品的質保[10]。在野生乳酸鏈球菌N8中過表達調控乳酸鏈球菌素合成的相關基因如磷酰基載體蛋白基因ptsh[11]、6-磷酸果糖激酶基因pfk及蛋白激酶催化亞基基因pkac[12]，能夠提高乳酸鏈球菌素的產量。納他霉素作為一種高效、安全的食品防腐劑，已被廣泛應用于奶酪、肉制品、果汁飲料等領域，被美國、南美、歐盟等30多個國家批準作為食品防腐劑使用[13]。將納他霉素生物合成基因簇中的特異性調控基因pimM、膽固醇氧化酶基因pimE導入褐黃孢鏈霉菌中過表達，可使納他霉素產量較出發菌株提高了17.77%和19.56%[14]。

1.1.2 食品著色劑

在食品著色劑方面，靛藍是一種安全的食用色素，在食品呈色中起重要作用。據文獻報道，假單胞菌屬[15]、紅球菌屬[16]及不動細菌屬[17]等微生物中含有加氧酶或羥化酶，是生物合成靛藍色素的優勢微生物。通過篩選高產靛藍色素的野生假單胞菌B4，并擴增其中的苯乙烯單加氧酶基因styab，與表達載體pBK-CMV連接后轉化至原宿主表達，能夠較好地提高天然靛藍色素的產量[18]。

1.1.3 食用香料

食用香料常用來配制食用香精或直接給食品加香，利用基因工程技術研究生產天然香料已備受香料界的關注[19]。2-苯乙醇具有玫瑰香氣，常作為食用香精為面包、啤酒等食品增香。酵母菌是其生物合成主要微生物，其中的脫羧酶基因ARO是關鍵合成基因。克隆ARO10基因并構建重組質粒后導入釀酒酵母S288C中過表達，可使轉化菌的2-苯乙醇的質量濃度提高至1.0 g/L，較原始菌提高16%[20]。在釀酒酵母W303-1B中同時過表達脫羧酶基因ARO80、ARO9和ARO10基因，能使2-苯乙醇產量較原始菌提高3.1倍[21]。乙偶姻具有令人愉快的奶油香味，常用于配制奶香型、草莓香型香精或直接用于奶制品增香，枯草芽孢桿菌是其生物合成的重要微生物[22]。在枯草芽孢桿菌JNA 3-10中分別過表達α-乙酰乳酸合成酶基因alsS和α-乙酰乳酸脫羧酶基因alsD，可使乙偶姻產量較野生菌提高5.2%和4.1%[23]。

1.1.4 白酒酯類

構建高產酯類的釀酒酵母并用于白酒生產是基因過表達技術的另一研究熱點[24]。中國白酒中酯含量較低，僅達到2%左右，釀酒酵母的產酯能力也極低，難以大量合成酯類物質，這些問題已長期困擾我國白酒界[25]。將高產酯類工程菌用于白酒釀造，不僅能提高單位時間內的產酯量，縮短發酵周期，減少糧耗，還能取代產酯微生物窖泥，避免窖泥微生物發酵產生異味物質。目前，已有大量關于提高濃香型白酒中己酸乙酯主體香含量的研究報道。研究者們通常選取磷酸甘油酸激酶基因pgk1作為上游調控元件，在其控制下過表達醇己酰基轉移酶基因eht1、乙酰輔酶A羧化酶基因acc1、脂肪酸合成酶1基因fas1及脂肪酸合成酶2基因fas2，將代謝通路定向至脂肪酸的合成，提高己酸乙酯的產量，促進果香形成[26-27]。李鋒等[28]曾在釀酒酵母AY15中過表達eht1，使己酸乙酯產量提高為原菌種的2.21倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量也分別提高了31.4%和49.1%。盡管目前鑒于食品安全問題，釀酒行業尚未將基因工程菌應用于實際生產，但工程菌的潛在價值是不可否認的。如何在安全規范、避免危害的前提下應用它，是進一步的研究方向。

1.2 增強野生菌株適應環境能力

食品發酵對微生物菌種有嚴格要求，微生物對發酵環境如溫度、pH、鹽分的適應能力是決定其能否成功投入工業化生產的重要因素。一些野生菌為了適應極端環境，往往會在其細胞內形成多種具有特殊功能的酶，這對食品發酵生產是十分有用的。基因過表達技術可以提高功能酶基因在菌株基因組中的占比，增加特定酶的產量，促進菌株適應環境。

1.2.1 耐高溫

醋酸菌在釀造食醋風味形成方面具有突出作用，其最適發酵溫度為30 ℃，夏季高溫會嚴重影響發酵速率。近年來，日本等國成功利用基因工程技術改良醋酸菌的耐高溫特性[29]。據報道，熱休克蛋白dnaK能在調節蛋白dnaJ的協助下耐高溫脅迫[30-31]，啟動子groESL易調控，在熱誘導條件下能加速轉錄。通過過表達dnaK、dnaJ及groESL基因，可以增強醋酸菌對高溫的耐受性，即使在42 ℃高溫條件下也能正常生長。

1.2.2 耐酸

在食醋釀造過程中，醋酸菌的耐酸能力直接影響其生產效果。高酸度的釀造醋不僅能夠節省儲存空間，方便食品加工業使用，還能在一定程度上抑制雜菌污染，減少生產損耗。醋酸菌發酵過程中的乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）與其耐酸性呈正相關，在醋酸菌中過表達ALDH酶基因，能夠提高菌種的耐酸性，最高耐酸度可達到98.6 g/L[32]。SHIGERU N等[33]研究發現，醋酸菌細胞膜中的蛋白質AatA是ABC轉運蛋白家族的一員，對醋酸、蟻酸、檸檬酸等具有耐性。通過在醋化桿菌中過表達aata基因，使工程菌在90.0 g/L時產平均酸速率較導入前40.0 g/L時速率幾乎相同，可以實現醋酸菌的耐高酸，并保持穩定的產酸速率。

1.2.3 耐鹽

耐鹽微生物在醬腌菜、調味品、肉的腌制品等鹽漬食品中應用得較多，通過正常的發酵作用，能抑制有害微生物的活動而起到防腐作用。食品中常見的耐鹽微生物有魯氏酵母菌、球擬酵母菌及葡萄球菌[34]等。魯氏酵母中的Na+/H+-反向轉運蛋白基因ZrSOD2與細胞膜H+-ATP酶基因ZrPMA1二者在耐鹽性中起到明顯的協同作用。構建含ZrSOD2和ZrPMA1基因的表達載體，導入釀酒酵母中過表達，能賦予酵母穩定的耐鹽性[35]。將具有耐鹽功能的大麥水通道蛋白基因HvPIP2;5和鋅指蛋白基因oslol5擴增后分別連接至質粒pYES2，并轉化至酵母菌中，均可增強其在高鹽滲透條件下的耐受性[36-37]。

2 工程菌的安全性及轉基因食品檢測技術

隨著人們生活水平的提升，食品安全問題備受關注，尤其是各國多年來頻繁出現許多食品安全事件，使得轉基因食品的安全性引起大家的爭議。雖然截止目前還未有實例報道工程菌在食品行業應用上存在明顯的危害性，但從理論角度出發，無論是技術性還是工業生產性，在一定程度上均存在一些弊端。在技術上，目的基因的過量引入可能會引起轉錄缺陷，激活其他代謝途徑，造成菌株惡性突變，在投入食品發酵過程中生成有毒、有害或其他引起食品變質的物質，嚴重損害食品質量，或是可能在融入食品后進入人體，對人體組織、細胞造成嚴重危害[38]。在工業生產上，工程菌屬于外源菌種，參與食品發酵可能會破壞原始菌群結構的平衡，對發酵環境造成不可修復的破壞。因此，采取有效的食品安全檢測技術對于保障食品安全、人體健康及降低對食品發酵環境的影響極其重要。

目前，常用于檢測轉基因食品的技術有單管巢式和半巢式聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術[39]、環介導溫擴增法[40]、液相芯片技術[41]及試劑條法[42]等。ZHOU D G等[43]運用環介導溫擴增法檢測轉基因甘蔗中的cry1Ac基因，結果最低檢出限為1.0 ng/μL。FU K等[44]對13種轉基因玉米品系進行多重PCR-液相芯片檢測，結果靈敏度達到0.1%，且探針和引物之間特異性較高。我國中科院生物技術研究所也研制出金杯免疫檢測試紙條[45]，可快速檢測轉基因植物中的Bt-Cry1Ab蛋白和Bt-Cry1Ac蛋白。

可見，無論是檢測效率、靈敏度還是適用范圍，轉基因食品檢測技術的發展都邁向了新臺階。科技在不斷進步，技術在日益更新。相信在科研工作者孜孜不倦的研究下，基因過表達技術的弊端會逐漸減少，檢測技術會更加快速準確，以確保轉基因食品的質量安全。

3 展望

具有特征功能的野生菌株是發酵食品行業的珍稀資源，但自身功能基因表達水平低、耐受性差等問題一直阻礙著人們對其的開發利用。而基因過表達技術在改良微生物菌種方面的能力非常突出，給多樣的菌種世界帶來了無限的可能性，它不僅能解決食品行業資源不足的問題，為食品的色、香、味和貯藏提供有力保障，還能提高耐受性基因在菌株基因組中的占比，實現工程菌的“身強體壯”，更好地滿足食品行業的生產需求。在一定程度上，野生菌株與基因過表達技術之間彰顯出較好的適配性，無論是菌株資源的充分利用，還是生物技術的強效運用，都是推動社會工業化發展的潤滑劑。

但是，由于人們對野生菌株的功能特性、生理生化特性及毒理學特性認知不全，基因過表達技術對于食品領域而言也存在安全性質疑，兩者結合是否會出現1＋1＞2的安全問題還需要更多的實踐證明。如何正確對待這些問題，關鍵是要將爭議擱置，在篩選野生菌株時做好全面細致的生理生化試驗與毒理學試驗，充分發揮基因過表達技術在微生物資源改造和利用方面的優勢，不斷挖掘利用轉基因食品檢測技術，制定完善的食品法律法規條例，使基因過表達技術和食品行業同步發展，才能更好的造福于人類，加速食品工業現代化進程。