狗棗獼猴桃 AkKCS蛋白的生物信息學分析

孫晶晶，陳 鑫，李然紅，王立鳳

(牡丹江師范學院，黑龍江 牡丹江 157012)

狗棗獼猴桃〔Actinidiakolomikta(Maxim. et Rupr.) Maxim.〕屬獼猴桃科獼猴桃屬大型落葉藤本植物，別名狗棗子。狗棗獼猴桃是我國東北地區最為耐寒的果樹品種之一，是良好的抗寒育種資源，果實富含多種維生素及氨基酸，其中維生素C含量較高。狗棗獼猴桃在不同季節呈現白、粉、紅、綠等不同顏色，是一種藥食觀賞兼用植物[1-3]。3-酮脂酰-CoA 合酶(KCS)是植物體超長鏈脂肪酸延伸過程中重要的限速酶，在整個延長循環中起十分重要的催化作用[4]。KCS蛋白作為轉錄因子，除了參與植物的生長發育，其中相當數量的成員在植物逆境響應中發揮重要功能。目前KCS基因已經在葡萄、擬南芥、滇牡丹、大豆、油菜、油茶、油桐等植物中被發現，并在相關領域研究取得一定成果[5]。陳柳等[6]在油菜種子中轉入KCS基因后發現，KCS基因能大幅提高種子中芥酸含量；HAN等[7]研究發現，KCS基因參與植物花和幼葉的表達，超表達能夠導致植株矮小、發育遲緩。筆者課題組首次在狗棗獼猴桃轉錄組中發現AkKCS基因，目前未見狗棗獼猴桃AkKCS蛋白的報道。鑒于此，以狗棗獼猴桃轉錄組為參考，篩選到AkKCS基因的cDNA序列，利用生物信息學方法對AkKCS蛋白的理化性質、疏水性/親水性、功能域、二級結構、三級結構、蛋白質修飾位點及同源性等進行預測和分析，旨在為深入研究狗棗獼猴桃AkKCS蛋白功能提供依據，并探明狗棗獼猴桃AkKCS蛋白與其抗寒性的內在聯系。

1 材料與方法

1.1 材料來源

狗棗獼猴桃AkKCS蛋白的cDNA序列數據來自于牡丹江師范學院遺傳育種實驗室轉錄組數據；中華獼猴桃變種(Actinidiachinensisvar.chinensis，PSS33602.1)、圓葉杜鵑(Rhododendronwilliamsianum，KAE9466640.1)、小果咖啡(Coffeaarabica，XP_027078202.1)、中粒咖啡(Coffeacanephora，CDP02779.1)、煙草(Nicotianatabacum，XP_016437717.1)、紫花風鈴木(Handroanthusimpetiginosus，PIM97319.1)、橡膠樹(Heveabrasiliensis，XP_021637941.1)、林煙草(Nicotianasylvestris，XP_009786212.1)、芝麻(Sesamumindicum，XP_011099559.1)、絨花煙草(Nicotianatomentosiformis，XP_009598968.1)、花生(Arachishypogaea，XP_025676000.1)、麻瘋樹(Jatrophacurcas，XP_012082087.1)等12種植物氨基酸序列在NCBI數據庫中下載。

1.2 方法

AkKCS蛋白的理化性質及等電點利用ProtParam和ProtScale預測，跨膜結構分析采用Signal P-4.1方法，保守結構域、二級結構和三級結構借助于NCBI-CDD、PredictProtein及SWISS-MODEL在線工具進行分析，同源性通過MAGA 5.1進行分析。分析工具及網絡地址詳見表1。

表1 AKLEA2蛋白的生物信息學分析工具及網址

2 結果與分析

2.1 AkKCS蛋白的理化性質

對AkKCS氨基酸序列預測結果表明，AkKCS蛋白開放閱讀框為1 693 bp，編碼496個氨基酸，分子式為C2533H4038N680O691S28，分子量5 5971 Da，理論pI為9.33，不穩定指數為40.75，脂肪系數為99.07，親水性平均水平0.011。AkKCS蛋白(氨基酸)中亮氨酸含量最多，其次為異亮氨酸，含量最少的為色氨酸。親水/疏水性分析結果(圖1)表明，AkKCS蛋白的整個肽鏈中均含有親水性和疏水性氨基酸，得分最大值為3.100，在75個氨基酸處；得分最小值為-3.689，在第287個氨基酸處。綜合分析認為，狗棗獼猴桃AkKCS為親水性不穩定蛋白。

2.2 AkKCS蛋白的跨膜結構預測

預測AkKCS蛋白結果(圖2)顯示，C、S、Y值均沒有出現明顯峰值，因此判斷該蛋白不存在跨膜結構。

2.3 AkKCS蛋白的結構域預測

NCBI-CDD序列的比對結果(圖3)表明，狗棗獼猴桃AkKCS蛋白為3-酮脂酰-CoA合酶KCS基因家族的成員(ID:PLN03212)之一，其保守結構域及功能位點位于第80～454氨基酸之間的序列區域，第80～368氨基酸之間含有FAE1合酶保守結構及其他查爾酮合酶保守結構域。

2.4 AkKCS蛋白的二級、三級結構預測

對AkKCS蛋白的二級結構預測結果表明，螺旋(Helix)為該蛋白的主要結構，占比50.2%；無規卷曲(Random coil)占比31.45%，延伸鏈(Strand)占比13.31%，5.04%為轉角(Turn)結構，沒有特殊結構。對AkKCS蛋白三級結構預測結果(圖4)表明，螺旋及無規卷曲為其主要結構，其在第80～368氨基酸附近含有位點功能。

2.5 氨基酸序列的同源性對比

狗棗獼猴桃AkKCS氨基酸序列與中華獼猴桃變種、圓葉杜鵑、小果咖啡、中粒咖啡、煙草、紫花風鈴木、橡膠樹、林煙草、芝麻、絨花煙草、花生、麻瘋樹等12種植物的KCS序列同源性分析結果(圖5)表明，狗棗獼猴桃AkKCS與中華獼猴桃原變種及圓葉杜鵑親緣關系較近，而與煙草等植物親緣關系較遠。

3 結論與討論

3-酮脂酰-CoA 合酶(KCS)是植物體超長鏈脂肪酸延伸過程中重要的限速酶，廣泛存在于植物體當中，葡萄、油菜、大豆、擬南芥中均已發現KCS基因，并被克隆及表達[8]。該研究首次在狗棗獼猴桃轉錄組數據中發現KCS基因，并對其進行生物信息學分析表明,AkKCS蛋白cDNA全長為1 693 bp，共編碼496個氨基酸，分子式為C2533H4038N680O691S28，分子量55 971 Da，屬于親水性不穩定蛋白，氨基酸含量多為亮氨酸和異亮氨酸，色氨酸含量較少。不含信號肽及跨膜結構，屬于3-酮脂酰-CoA合酶KCS基因家族的成員(ID:PLN03212)，具有KCS的保守結構域。二級結構以螺旋為主，與三級結構預測結果相符。AkKCS氨基酸序列與中華獼猴桃原變種及圓葉杜鵑親緣關系較近，與煙草及其他植物親緣關系較遠。研究結果可為狗棗獼猴桃AkKCS基因功能進一步分析提供一定理論基礎。