基于處方挖掘與藥效團模型的新型冠狀病毒RdRp抑制成分篩選

李 婧，韋繽琪，李可馨，蘇學燕,3，張志鋒,3*

1西南民族大學藥學院；2四川大學生物治療國家重點實驗室，成都 610041；3四川省羌彝藥用資源保護與利用技術工程實驗室，成都 610225

2019年12月，一種新型冠狀病毒疾病在武漢市暴發，截止到2020年10月21日，全世界已累計有4 000多萬人被感染，死亡110萬余人，給全世界人民的生命和健康構成巨大威脅，目前已被世界衛生組織(WHO)評估認定為進入全球大流行狀態。2020年2月11日，WHO將該疾病命名為新型冠狀病毒疾病(COVID-19)，是一種由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的急性感染性肺炎[1]，患者初始癥狀多為呼吸道癥狀、發熱、咳嗽、氣促和呼吸困難等，重癥患者可導致肺炎、嚴重急性呼吸綜合征、腎衰竭，甚至死亡[2]。2020 年3 月4 日，國家衛健委發布了《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[3]，治療主要采用α-干擾素、洛匹那韋/利托那韋、利巴韋林、磷酸氯喹、阿比多爾等抗病毒藥物治療，同時推薦采用連花清瘟膠囊、清肺排毒湯等中藥聯合治療。然而，目前針對SARS-CoV-2 感染尚無特效藥物，因此，研究針對抗COVID-19 療效顯著的新治療方法和藥物十分迫切。

COVID-19具有強烈的傳染性和流行性，以“濕、熱、毒、瘀”為主要特征，治療原則為早治療、早診斷，重祛邪，防傳變[4]。根據《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》推薦中藥包括：清肺排毒湯、藿香正氣膠囊、金花清感顆粒、連花清瘟膠囊、疏風解毒膠囊、喜炎平注射液以及多種中藥復方[3]。在臨床實踐中，各大醫院根據其臨床經驗及病人的情況采用中西藥結合進行個性化治療，也總結出一系列具有較好臨床療效的中藥處方。這些復方的療效經過了臨床檢驗，在我國抗COVID-19 的過程中發揮了獨特的作用，為尋找抗新冠活性成分提供了豐富的物質和理論基礎。

SARS-CoV-2是一種RNA病毒，病毒自身編碼的RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，在病毒的RNA復制過程中起到關鍵作用。因此RdRp抑制劑可作為抗RNA 病毒的廣譜抗病毒藥物[5]，目前療效明確的新冠RdRp抑制劑包括瑞德西韋、利巴韋林及法匹拉韋[6]等。近期“清華大學-上?？萍即髮W抗新冠病毒聯合攻關團隊”在全世界率先成功解析新型冠狀病毒“RdRp-nsp7-nsp8復合物”近原子分辨率的三維空間結構，揭示了該病毒遺傳物質轉錄復制機器核心“引擎”的結構特征，為開發針對新冠肺炎的藥物奠定了重要基礎。

藥效團模型是一種基于配體的藥物設計工具，從已知活性化合物的結構出發尋找共有的藥效特征信息，從而指導新化合物的理性設計或虛擬篩選[7]。近年來，藥效團模型被廣泛應用于中藥活性成分的篩選[8]。本文收集了目前幾種療效確切的RdRp小分子抑制劑作為訓練集，利用HipHop方法建立三維藥效團模型。將產生的藥效團與常用抗新冠處方藥材中活性成分進行匹配，預測“抗新冠候選活性成分”中具有潛在新冠病毒RdRp抑制作用的成分及其與該靶標的結合模式，并且建立一種快速高效的新冠病毒RdRp抑制劑篩查模型，為后續實驗研究及臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 常用中藥處方挖掘及藥材候選活性成分數據庫建立

根據《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》以及全國各地新型冠狀病毒處方全面搜集抗新冠中藥處方，根據研究報道篩選臨床療效較好的處方作為候選處方。根據對處方中的藥材進行搜集及用藥頻次統計，以高頻藥材作為重點研究對象，建立候選藥材數據庫。通過中藥系統藥理學分析平臺數據庫(TCMSP)搜集候選藥材數據庫中每種藥材的主要化學成分。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-like，DL)≥0.18為參考評估候選化合物。此外，在CNKI及PubMed數據庫中查候選藥材相關文獻，搜集每種藥材主要活性成分，與在TCMSP數據庫篩選到的活性物質進行整合及確證，建立“抗新冠候選活性成分數據庫”，并在TCMSP數據庫及PubChem數據庫下載化合物3D結構，確認結構無誤后保存。

1.2 藥效團的構建及驗證

1.2.1 訓練集化合物的選取及HipHop藥效團模型建立

Discovery Studio 軟件中Pharmacophore項下Common Feature Pharmacophore Generation 模塊可用于發現一系列配體小分子化合物共有的化學特征，根據這些共同特性結構比對疊合自動生成藥效團模型[9]。參照Liu等[10]的藥效團構建方法，本研究使用Discovery Studio 2016軟件構建基于小分子配體的HipHop藥效團模型。根據文獻報道選取6個具有RdRp抑制活性的小分子化合物作為訓練集[5,6,11,12]，訓練集化合物結構及RdRp抑制活性(EC50)見圖1，其中rbavirin、remdesivir、favipiravir及penciclovir 的EC50值為對SARS-CoV-2抑制活性，Galidesivir的EC50值為對SARS病毒(SARS-CoV)抑制活性，sofosbuvir的EC50值為對丙型肝炎病毒(HCV)的抑制活性?；谟柧毤行》肿拥墓餐卣鹘Y構比對疊合自動生成藥效團模型。將訓練集中SARS-CoV-2 RdRp抑制活性最高的化合物瑞德西韋(remdesivir，EC50=0.77 μM)Principal值預設為2，作為建立藥效團的建模時主要需參考配體的構象，其他5個化合物Principal 值預設為1，作為建立藥效團的建模時次要需參考配體的構象。所有化合物MaxOmitFeat 值設為1，表示建模結果可以有一個特征元素與之不匹配。在HipHop模塊輸入參數時選擇氫鍵受體(hydrogen bond acceptor，A)、氫鍵供體(hydrogenbond donor，D)、疏水基團(hydrophobic region，H)、正電中心(positive ionizable，PI)、芳環(ringaromatic，R)等5項作為藥效團的特征元素，每個藥效元素的范圍設定為0～5，藥效團模型設定為采用Best模式進行疊合，經過運算后得出10個得分最高的藥效團模型作為候選模型。

圖1 訓練集化合物的結構與EC50Fig.1 Chemical structures and EC50 of training set compounds

1.2.2 藥效團模型的評價驗證

選取具有RdRp抑制活性的6種化合物和30種未見RdRp抑制活性報道的化合物組成測試集。用測試集化合物對藥效團模型的性能進行評價，采用Discovery Studio中Pharmacophore 項下的Ligand Profiler 模塊，選擇Best 模式進行評價，選取在評分值盡可能高的情況下與活性化合物匹配度高及與非活性化合物匹配度較低的藥效團作為優選藥效團模型。

1.2.3 基于藥效團模型SARS-CoV-2 RdRp抑制活性成分虛擬篩選

得到優選藥效團后，將“1.1”項中得到的“抗新冠候選活性成分數據庫”中活性成分結構與優選藥效團采用Discovery Studio進行匹配并分析結果。模式為Best Search，MaxOmitFeat 值設為0，其余為默認參數。選取匹配值(FitValue)較高的化合物作為潛在活性化合物。

1.3 潛在活性化合物的分子對接驗證

將“1.2.3”中得到的潛在活性化合物小分子化合物3D坐標文件，在pymol中檢查空間結構無誤后，利用openbabel轉換為pdb格式。將結構文件載入autodocktool 1.5.6程序，添加原子電荷，分配原子類型，所有柔性鍵均默認可旋轉。保存為pdbqt格式，作為對接配體。本研究靶蛋白“SARS-CoV-2病毒RdRp-nsp7-nsp8復合物”蛋白結構由上海科技大學饒子和院士團隊提供。采用AutoDock Tools1.5.6 軟件刪除RdRp蛋白中水分子，分離配體和受體，添加非極性氫，計算Gasteiger電荷，保存為pdbqt文件。根據研究報道的remdesivir與SARS-CoV-2病毒RdRp蛋白結合位點設置RdRp蛋白對接的Gridbox坐標及大小[13]。以SARS-CoV-2病毒RdRp蛋白作為受體，以潛在活性化合物為配體，采用AutoDock Vina進行分子對接，根據對接結果初步評價小分子配體與受體的結合情況。

2 結果與分析

2.1 根據常用中藥處方建立“抗新冠候選活性成分數據庫”

根據《新型冠狀病毒肺炎診療方案》及全國各地新型冠狀病毒常用處方篩選到31個中藥處方作為候選處方。分析處方藥材并進行藥材使用頻數統計，使用頻數≥5的藥材作為高頻使用藥材。共搜集到候選藥材92種，其中高頻使用藥材21種，包括甘草、藿香、黃芩、麻黃、石膏、連翹、厚樸、黃芪、杏仁、白術、半夏、金銀花、柴胡、蒼術、茯苓、陳皮、生姜、草果、葶藶子、梔子及檳榔。以高頻使用藥材為重點搜集對象，通過TCMSP 數據庫以OB≥30%，DL≥0.18為標準篩選得到的候選活性成分與文獻收集的主要成分及抗病毒活性成分相整合，共得到1 384個候選成分，建立“抗新冠候選活性成分數據庫”。候選活性成分篩選流程圖見圖2。

圖2 抗新冠候選活性成分篩選流程圖Fig.2 Screening flow chart of the candidate active ingredients against COVID-19

2.2 HipHop藥效團模型建立及驗證

以訓練集6個活性化合物采用HipHop方法共產生10個藥效團模型，結果參數見表1。評分值參考了訓練集分子與藥效團模型的匹配度，第01、02、03、07、08、09號藥效團藥效特征為DAA，第04、05、06、10號藥效團藥效特征為DDA，6個化合物有5個與所有藥效團完全匹配，1個部分匹配。生成的10個藥效團評分都超過了40分，說明測試集所選的分子共同特征較為明顯，排前幾位的藥效團評分較為接近，因此結合圖3中藥效團熱圖的結果選取最佳藥效團，其中冷色調代表對配體響應較低，而暖色調代表藥效團對配體響應度較高。由圖可見，匹配共命中10個化合物，其中編號1001～1006的5個化合物為活性化合物(1001-ribavirin、1002-remdesivir、1004-galidesivir、1005-penciclovir、1006-sofosbuvir)，其他5個化合物為非活性化合物。藥效團02對于測試集中活性化合物的響應度較高，而對于非活性化合物的響應值較低，符合本研究對于藥效團的要求，結合圖3中幾種藥效團打分情況，02藥效團打分(Rank)最高，故選擇藥效團02作為優選藥效團模型進行后續研究。優選藥效團模型如圖4A，由圖可見，優選藥效團02主要由1個氫鍵供體(HBD)和2個氫鍵受體(HBA)和構成。而整個模型的氫鍵供體與遠端的氫鍵配體距離為17.698?，對所匹配的小分子配體的尺寸有一定的限制作用?；钚宰顝姷幕衔飏emdesivir與優選藥效團的FitValue為3.0，與藥效團疊合效果見圖4B。

表1 10個基于分子共同特征的藥效團的結果參數Table 1 The parameters of ten common features of pharmacophore

圖3 10個生成的藥效團對測試集分子的驗證熱圖Fig.3 Heat map of 10 generated pharmacophore models evaluated by test set注：1001-Ribavirin；1002-Remdesivir；1004-Galidesivir；1005-Penciclovir；1006-Sofosbuvir。

表2 候選活性成分中FitValue排名前30且結合自由能低于remdesivir的主要活性成分信息Table 2 Basic information of the potential active ingredients in candidate active ingredients ranking according to FitValue (top 30) and binding free energy (

2.3 優選藥效團對“抗新冠活性成分數據庫”中SARS-CoV-2 RdRp潛在抑制成分的虛擬篩選

用“2.1”中優選的RdRp抑制劑藥效團模型對“1.1”中得到的“抗新冠活性成分數據庫”中1 384種成分進行虛擬篩選，命中104個化合物，選取其FitValue排名前30的化合物(FitValue>2.3)作為新型冠狀病毒RdRp潛在抑制活性成分進行后續研究，潛在活性化合物信息見表2，表中為FitValue排名前30且與RdRp結合自由能低于remdesivir(<﹣7.2 kcal/mol)的重要潛在活性化合物。藥效團匹配到的FitValue最高的6種潛在活性化合物見圖5，由圖可見，從圖中可以看出6種化合物藥效團的3個特征元素都能很好地匹配，主要為酚羥基對應氫鍵供體，羥基或羰基對應氫鍵受體。

圖4 HipHop產生的最優藥效團模型(A)及其與remdesivir疊合結果(B)Fig.4 The optimized pharmacophore model (A) and mapping of compound remdesivir on it (B)

圖5 藥效團02匹配到的候選成分中FitValue最高的6種潛在活性化合物Fig.5 The matching pattern diagram between pharmacophore model 02 and top 6 potential active constituents from candidate ingredients注：A.Liquiritin apioside；B.Iridin；C.Liquiritin；D.Forsythiaside；E.Procyanidin B-5,3′-O-gallate；F.Saikosaponin C。

2.4 RdRp抑制作用潛在活性成分分子對接驗證

以“2.2”中得到的“抗新冠候選成分數據庫” 中RdRp抑制作用潛在活性成分為配體，以SARS-CoV-2病毒RdRp蛋白為受體，根據研究報道[13]的remdesivir與SARS-CoV-2病毒RdRp蛋白結合位點設置RdRp蛋白對接的Gridbox坐標及大小，配體設置為柔性，受體剛性，采用AutoDock Vina 1.1.2進行分子對接。選取打分最高(affinity數值最低)的構象作為對接構象，利用pymol對對接構象進行可視化分析。每種活性成分對接結果幾種結合構象中，選取結合能較低且構象較好的結果作為分子對接結果。分子對接結合自由能越小說明受體配體之間親和力越大，我們以remdesivir與RdRp的結合自由能(-7.2 kcal/mol)作為參考來判定待測化合物的親合力。候選成分中RdRp抑制作用潛在活性成分對接結果見表2(結合自由能低于remdesivir)。FitValue最高的6種潛在活性化合物與SARS-CoV-2病毒RdRp蛋白分子對接圖如圖6。根據研究報道[13]，SARS-CoV-2病毒RdRp蛋白與remdesivir結合的活性口袋位于RdRp復合物蛋白中心的空腔，潛在結合位點包括545、555、682、623、687、691、759、760、761等。由圖6可見，以上6種化合物能與報道的SARS-CoV-2病毒RdRp蛋白中心活性口袋結合，并與以上關鍵結合位點中的多個發生了相互作用。圖中liquiritin apioside 及iridin均在LYS-621位點產生氫鍵作用；liquiritin apioside 及pocyanidin B-5,3′-O-gallate均在ASP-760位點產生氫鍵作用；Iridin及procyanidin B-5,3′-O-gallate均在ASP-761位點產生氫鍵作用；liquiritin apioside及forsythiaside均在ASP-164位點產生氫鍵作用；liquiritin apioside及Iridin均在GLU-811及TRP-800位點產生氫鍵作用;iridin及procyanidin B-5,3′-O-gallate均在LYS-798位點產生氫鍵作用;iridin、procyanidin B-5,3′-O-gallate及saikosaponin C均在TYR-619位點產生氫鍵作用。

此外以上多個化合物與PRO-620發生Pi-Alkyl相互作用，與ASP-618發生Pi-Cation相互作用。以上這些位點可能是活性成分與RdRp蛋白作用的潛在位點。

2.5 基于篩選結果的潛在活性結構分析

我們將表2中FitValue排名前30且結合自由能低于remdesivir(-7.2 kcal/mol)的化合物進行分類，發現其中53%的化合物骨架類型為黃酮類，主要為黃酮、二氫黃酮、雙黃酮、黃酮醇類。提示黃酮類化合物可能具有潛在SARS-CoV-2 RdRp抑制活性。RdRp抑制劑主要有兩類，即核苷/核苷酸類似物(NI)和非核苷抑制劑(NNI)。NI能成為RNA依賴的RNA聚合酶的底物,可參入到RNA鏈中抑制病毒。NNIs與RdRp變構位點之一結合，這種結合改變酶的3D構象，從而在起始步驟破壞聚合酶活性[11,12]。有研究表明，多種黃酮類化合物對HCV病毒的RdRp具有抑制活性[13]。該研究發現黃酮醇、黃酮、二氫黃酮及其苷類對HCV病毒的RdRp具有不同程度的抑制活性，與本研究篩選到的黃酮類化合物結構上具有一定的相似性。

此外，該研究以槲皮素為例進行了多項實驗，發現槲皮素能在病毒RNA模板通道的入口處與病毒結合，通過非核苷抑制作用抑制RNA與酶的結合發揮RdRp抑制作用，可能是一種與高泛基因組活性和高抗性屏障有關的新作用機制。該研究也為黃酮類物質的化學改良和大規模基于結構的抗病毒藥物分子篩選提供了參考。還有研究表明，黃酮類物質水飛薊素對HCV病毒RdRp有抑制作用，水飛薊素可能不是通過阻斷HCV細胞系與細胞的結合，而是抑制了病毒假顆粒(pp)的進入，從而抑制了HCVpp與脂質體的融合發揮抑制病毒作用[14]。還有研究表明雙黃酮類化合物對登革病毒聚合酶DENV-NS5 RdRp具有抑制作用[15]，本研究篩選到procyanidin B1與procyanidin B-5,3′-O-gallate為雙黃酮類成分，且與RdRp結合自由能均<﹣8 kcal/mol，提示這兩種化合物與RdRp可能具有潛在作用。以上研究為本研究結果提供了相關實驗證據，然而黃酮類化合對于SARS-CoV-2 RdRp是否有抑制作用尚需后期實驗證實。

從對接的結果可以看出，由于黃酮類結構含有多個富電子的氧原子，易于與RdRp 靶點殘基中的供電子基團形成氫鍵，故黃酮類結構作為潛在的抗RdRp活性化合物的骨架是合理的。我們把FitValue排名靠前且結合自由能低于remdesivir的30個黃酮類化合物作為重要黃酮類活性成分進行分析，與RdRp蛋白殘基互作圖見圖7。在黃酮活性化合物中，氫鍵多在黃酮骨架上A 環的C-7位(liquiritin apioside、liquiritin、procyanidin B-5,3′-O-gallate、rutin、isovitexin、ochnaflavone、Procyanidin B1及licorice glycoside E)及C環的C-3位(iridin、procyanidin B-5,3′-O-gallate、hesperidin、neohesperidin、procyanidin B1、ochnaflavone及isomucronulatol-7,2′-di-O-glucosiole)或C-4位(cynaroside、veronicastroside、neoliquiritin 及procyanidin B1)上產生，由此推測上述位置的取代基可能對化合物的活性有一定影響。

圖7 潛在活性成分中重要黃酮類成分與RdRp蛋白殘基互作圖Fig.7 Interaction of protein residues between RdRp and the important flavonoids in potential active ingredient注：A.Liquiritin apioside；B.Iridin；C.Liquiritin；D.Procyanidin B-5,3′-O-gallate；E.Neohesperidin；F.Cynaroside；G.Veronicastroside；H.Naringin；I.Procyanidin B1；J.Hesperidin；K.Ochnaflavone；L.Neoliquiritin；M.Isomucronulatol-7,2′-di-O-glucosiole；N.Licorice glycoside E；O.Isovitexin,P. Rutin。

3 討論

COVID-19屬于“瘟疫”范疇，以“濕、熱、毒、瘀”為主要特征，并與運氣、地理、氣候和人群的易感性相關，其病位在膜原，涉及三焦、肺、脾、胃，采用清熱除濕解表藥在新冠肺炎的防治中有重要的作用[16]。本研究對于臨床常用的31個抗新冠常用中藥處方的組成藥物進行頻次統計，其中使用頻次≥5 的有21味中藥(圖1)。使用頻次較高的藥材大致歸納為：補氣健脾藥、清熱藥、解表藥、祛濕藥。補氣健脾藥(黃芪、甘草、白術、厚樸、杏仁)；清熱藥(金銀花、甘草、連翹、麻黃、黃芩、石膏、葶藶子、梔子)；解表藥(金銀花、連翹、藿香、麻黃、柴胡、生姜)；祛濕藥(白術、藿香、陳皮、蒼術、黃芩、茯苓、厚樸、半夏、草果、檳榔)等。

SARS-CoV-2 屬于β屬的新型冠狀病毒，SARS-CoV-2可通過刺突糖蛋白(S蛋白)的S1亞基上的受體結合域(RBD)與宿主細胞表面的血管緊張素轉化酶2(ACE2)之間的結合，通過內吞作用進入宿主細胞[17]。SARS-CoV-2病毒進入細胞后，核衣殼與病毒自身的正義鏈RNA釋放到細胞質中，由木瓜蛋白酶樣蛋白酶(PLpro)和主蛋白酶(3CLpro)參與裂解，最終產生包括螺旋酶(Helicase)和RNA 依賴性RNA 聚合酶(RdRp)在內的非結構蛋白，參與病毒轉錄、復制過程[18]。病毒自身編碼的RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)在SARS-CoV-2病毒的RNA復制過程中起到關鍵作用，RdRp也是目前針對SARS-CoV-2作用明確且研究較多的靶點。本研究探索從常用抗新冠中藥材中尋找RdRp抑制劑，也為更好的闡明中藥抗新冠作用機制提供參考。本研究根據TCMSP數據庫及文獻挖掘搜集了常用抗新冠藥材中1384種候選活性成分，根據已報道的具有RdRp抑制活性的6種化合物構建了藥效團模型并進行了驗證，選取最優藥效團模型與“抗新冠候選活性成分”進行了虛擬篩選，在匹配得到的化合物中選取FitValue較高的化合物作為潛在RdRp抑制活性成分，本研究發現lquiritin apioside、iridin、liquiritin、forsythiaside、procyanidin B-5,3′-O-gallate、saikosaponin C等成分具有較高的FitValue，可作為RdRp抑制的潛在活性成分。通過分類分析發現篩選產物中有較多黃酮類成分，與文獻報道的黃酮類化合物抑制病毒RdRp作用有一定相似性，提示黃酮骨架可能具有抑制SARS-CoV-2 RdRp的活性。我們還篩選到一些五環三萜類成分，主要是saikosaponin，有研究報道saikosaponins A、C、B、D具有抗流感、HBV、HCV等病毒活性[19-21]。研究還發現一些有苯丙素類具有RdRp潛在抑制活性，主要包括forsythiaside(連翹苷)及綠原酸類似物，有研究報道連翹苷A可通過抑制病毒復制控制甲型流感病毒感染[22]；連翹苷A還可通過影響小鼠肺免疫細胞中RLRs信號通路，減輕流感病毒FM1株在小鼠肺中引起的炎癥反應[23]。Isochlorogenic acid A及chlorogenic acid具有抗流感病毒、HBV等病毒活性[24,25]。然而五環三萜及苯丙素類成分是否對病毒RdRp具有抑制活性尚未見報道，需進一步試驗研究證實。本研究采用remdesivir作為重要模板進行活性基團模型構建，有研究報道remdesivir三磷酸化后的形式為其活性形式[13]，但考慮到remdesivir三磷酸化物的不穩定性，因此研究采用了remdesivir原型作為藥效團模型。

綜上，本研究通過對抗新冠常用中藥處方挖掘及數據庫搜集，建立了“抗新候選活性成分數據庫”，基于已報道的具有RdRp抑制活性的化合物構建了HipHop藥效團模型并對候選成分進行匹配，對FitValue排名并進行分子對接驗證，選取FitValue較高且結合自由低于對照藥物remdesivir的前30種化合物進行分析，得到具有RdRp潛在抑制活性的化合物及活性結構。本研究結果為抗SARS-CoV-2活性成分篩選提供了新思路及參考。