大黃素調(diào)控miR-21介導細胞自噬減輕糖尿病腎病小鼠腎臟氧化性損傷機制研究

齊寶寧，熊永愛，潘艷芳，徐守竹，紀明睿，王嘉欣，王 一，鄒佳盈

1陜西中醫(yī)藥大學校醫(yī)院，西安712046；2遵義醫(yī)科大學藥學院，遵義563000；3陜西中醫(yī)藥大學公共衛(wèi)生學院，西安712046

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的嚴重繼發(fā)性腎小球疾病，也是慢性腎衰竭的常見原因。血糖過高可引發(fā)腎臟氧化應激，導致活性氧(reactive oxygen species，ROS)在腎臟固有細胞內(nèi)蓄積，可造成足細胞、內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞和系膜細胞等的氧化損傷，加劇DN的發(fā)生發(fā)展[1]。自噬是真核細胞內(nèi)維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要內(nèi)降解機制，作用在通過溶酶體蛋白的降解，清除受損的結構或過度表達的蛋白，參與維持細胞更新和細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。DN病理生理過程與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、線粒體功能障礙及炎癥反應密切相關，細胞自噬清除錯誤的折疊蛋白和受損細胞器，促使自噬體形成和自噬-溶酶體的融合，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞凋亡。氧化應激狀態(tài)下產(chǎn)生的ROS可誘導自噬發(fā)生，自噬可以清除自由基緩解氧化應激對腎組織和細胞的損傷，是細胞的重要促生存機制。有效誘導自噬，控制炎癥過程是治療DN的有效策略。

近年來研究表明，微RNAs(microRNAs，miRNAs)在DN患者中異常表達并參與系膜細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)聚集及足細胞損傷等DN的病理過程，尤其是microRNA-21(miR-21)更是成為研究的熱點。miR-21普遍存在并調(diào)節(jié)細胞分化、增生、凋亡，國內(nèi)外多項研究發(fā)現(xiàn)，DN患者血清miR-21濃度顯著高于正常人，且在DN患者腎組織活檢中發(fā)現(xiàn)miR-21與腎小管間質(zhì)纖維化呈正相關[2,3]。因此，沉默miR-21或抑制其表達對抑制糖尿病長期或短期并發(fā)癥有重要意義。而miR-21被報道可通過調(diào)控Akt/mTOR、PTEN等信號通路調(diào)控細胞自噬[4]。但目前國內(nèi)外文獻中未見通過調(diào)控miR-21介導細胞自噬減輕糖尿病腎病腎臟氧化性損傷相關報道。

大黃素(emodin，EM)是蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.和藥用大黃RheumoffcihaleBaill.的有效活性成分，屬于蒽醌類化合物，具有抑菌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、改善腎功能等藥理作用[5,6]。前期研究發(fā)現(xiàn)[7]，大黃素可通過抑制高糖誘導的腎小球膜細胞增殖，促進系膜細胞凋亡來延緩DN的進展。預實驗結果也顯示，25 mmol/L葡萄糖可以顯著促進腎小球系膜細胞miR-21的表達。本研究擬從調(diào)控miR-21介導細胞自噬探討大黃素減輕糖尿病腎病小鼠腎臟氧化性損傷的作用機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

SPF級小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK(陜)2012-002。

大黃素(emodin，CAS：518-82-1，成都格利普生物科技有限公司)；anti-P62(貨號ab227207，英國abcam公司);anti-Atg7(貨號ab80639，英國abcam公司)，anti-LC3(貨號ab128025，英國abcam公司);小鼠血尿素氮(BUN)Elisa試劑盒(貨號YS06475B，上海雅吉生物科技有限公司);肌酐(Cr)Elisa試劑盒(貨號YS059871B，上海雅吉生物科技有限公司);尿白蛋白排泄率(uAE)Elisa試劑盒(貨號YS035742B，上海雅吉生物科技有限公司)；鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司。血糖試紙購自三諾生物傳感股份有限公司。

1.2 實驗儀器

JEM-F200型透射電鏡(日本電子株式會社)；BJ005266型PCR儀(美國Bio-Rad公司)；BG-verMIDI型垂直式電泳儀(北京百晶生物技術有限公司)；Image Lab型凝膠分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；MK3型多功能酶標儀(美國ThermoFisher儀器有限公司)；FPMIC-razoII型病理切片機(孚光精儀(中國)有限公司)。

2 實驗方法

2.1 DN模型建立

實驗小鼠適應性飼養(yǎng)3天后，喂養(yǎng)高脂高糖飼料(實驗室自制。配方：豬油∶蔗糖∶蛋黃∶基礎飼料=18∶20∶3∶59)，連續(xù)8周，自實驗第1天開始按100 mg/kg劑量腹腔注射STZ檸檬酸鈉溶液，連續(xù)7天。實驗第8天尾靜脈檢測小鼠血糖水平，以血糖大于16.7 mmol/L為糖尿病模型成模標準。DN小鼠需具備以下條件：隨機血糖大于13.8 mmol/L，并伴有胰島素抵抗；出現(xiàn)尿蛋白、腎功能異常及相應腎組織病理學特征，視為模型建立成功[5]。造模及各實驗組給藥時間節(jié)點見圖1。

圖1 造模及各實驗組給藥時間節(jié)點Fig.1 Model and administration time points of each group

2.2 分組與給藥

選擇模型建立成功的小鼠，按體重隨機分為模型組(model)、格列美脲組(glim，0.6 mg/kg/d，ig)、Emo高劑量組(50 mg/kg/d，ig)、Emo低劑量組(25 mg/kg/d，ig)，每組10只。另取10只未建立模型小鼠作為正常組(normal)。自造模第7周開始灌胃(ig)給藥，連續(xù)7天。實驗第8天，尾靜脈取血檢測血糖(blood glucose，BG)，取血后用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，頸椎離斷處死后取腎臟，置冰臺上去除被膜，濾紙吸干血跡后稱質(zhì)量。部分小鼠腎臟處理如下：取少量左腎上極皮質(zhì)固定于預冷的2.5%戊二醛中，用于電鏡檢測；其余腎臟縱向切開，1/4置于10%中性福爾馬林中固定，然后進行PAS染色，另外1/4腎臟進行冰凍切片。部分小鼠腎臟用于分離腎小球。

3 檢測指標

3.1 腎臟重量系數(shù)檢測

以左右兩側腎臟重量(mg)除以小鼠體重(g)來作為腎臟重量系數(shù)(mg/g)。

3.2 病理形態(tài)學檢測

實驗結束后，取各實驗組小鼠腎臟組織，經(jīng)10%中性福爾馬林固定48 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色，電子顯微鏡檢測腎臟病理形態(tài)改變。

3.3 腎小球ROS含量檢測

采用ROS熒光探針-二氫乙啶法(dihydroethidium，DHE)檢測各實驗組小鼠腎臟ROS含量。DHE可自由透過活細胞膜進入細胞內(nèi)，并被細胞內(nèi)ROS氧化形成氧化乙啶，氧化乙啶可摻入染色體DNA中，產(chǎn)生紅色熒光。再利用流式細胞儀測定ROS陰性細胞和ROS陽性細胞的比值即可表征腎小球ROS含量。

3.4 腎臟生化指標檢測

取各實驗組小鼠腎臟組織，以生理鹽水為勻漿介質(zhì)手動勻漿，3 000 rpm離心10 min，取上清勻漿液，ELISA測定腎臟組織BUN、Cr、uAE含量。

3.5 電鏡檢測

取小鼠腎臟皮質(zhì)組織，用3%的戊二醛固定3 h，再用1%的鋨酸固定1 h，50%～90%的丙酮梯度脫水，Epon812包埋。取包埋塊進行薄切片，甲苯胺藍染色，光鏡下半薄定位后進行超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色，最后在透射電鏡下觀察各實驗組腎臟足細胞自噬情況。

3.6 RT-qPCR檢測

TRIzol法提取腎臟組織RNA，使用逆轉錄試劑盒獲得cDNA，進一步使用SYBR-Green在PIKO Red96 RT-PCR擴增儀上進行qPCR。以U6為內(nèi)參，檢測各實驗組小鼠腎臟miR-21水平。所用引物如下：miR-21：5′-UACTAUUCCAAAGAAGTCACCAC-3′；U6：5′-CGATGTTGACATCCGTAAAGACC-3′。

3.7 Western blot檢測

取腎臟組織約100 mg，樣品加適量RIPA buffer細胞裂解液，細胞樣品器反復吹打，組織樣品使用超聲波細胞破碎儀進行破碎，然后冰上孵育30 min。12 000 rpm，4 ℃離心20 min，轉移上清至新管。使用Lowry法測定上清液中蛋白含量，根據(jù)蛋白含量制作樣品。SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白電轉到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS中封閉，加入一抗，4 ℃封閉過夜；第2天用TBS洗膜3次，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫下?lián)u床上孵育1 h；取出 PVDF膜，用TBST洗3次，每次5 min。應用全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)成像，使用ScionImage軟件對蛋白電泳帶進行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參照蛋白進行校準，采用目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值來表示p62、Atg7、LC3的相對蛋白表達水平。

3.8 統(tǒng)計學分析

圖2 大黃素對DN小鼠腎臟重量指數(shù)的影響Fig.2 Effects of emodin on kidney weight index in DN mice注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。Note:Compared with normal,△ P<0.05;Compared with model,* P< 0.05.

4 實驗結果

4.1 對小鼠腎臟重量系數(shù)的影響

實驗結果如圖2所示。與正常組比較，模型組小鼠腎臟重量系數(shù)顯著增大(P<0.05)；與模型組比較，大黃素給藥組小鼠腎臟重量系數(shù)顯著減小(P<0.05)。表明大黃素口服給藥可明顯減輕DN小鼠腎臟炎性水腫。同時Glim組小鼠腎臟重量系數(shù)較模型組比較也顯著減小(P<0.05)。

4.2 對小鼠腎臟病理形態(tài)的影響

實驗結果如圖3所示。圖3A所示，正常組小鼠毛細血管清晰，呈網(wǎng)狀，系膜區(qū)未見增生。DN小鼠炎癥性水腫、纖維化明顯，如圖3B所示。大黃素高、低劑量組小鼠腎臟結構基本恢復正常，圖3D和圖3E所示。

圖3 各實驗組小鼠腎臟病理形態(tài)(HE，×200)Fig.3 Pathological morphology of mouse kidney in each experimental group(HE，×200)注：A:Normal；B:Model；C:Glim；D:Emo 50 mg/kg；E:Emo 25 mg/kg，下同。 Note:A:Normal;B:Model;C:Glim;D:Emo 50 mg/kg;E:Emo 25 mg/kg,the same below.

4.3 各實驗組小鼠腎臟ROS含量比較

實驗結果如圖4所示。與正常組比較，模型組小鼠腎臟ROS含量顯著增大(P<0.05)；與模型組比較，大黃素給藥組小鼠腎臟ROS含量顯著減少(P<0.05)。表明大黃素口服給藥可明顯清除DN小鼠腎臟ROS。Glim組小鼠腎臟ROS與模型組比較無顯著變化。

4.4 對DN小鼠血糖(BG)和腎臟BUN、Cr、uAE含量的影響

實驗結果如表1所示。與正常組比較，模型組小鼠BG、BUN、Cr和uAE含量均顯著增大(P<0.05)；與模型組比較，大黃素高、低劑量組小鼠BG、BUN、Cr和uAE含量均顯著降低(P<0.05)。同時Glim組小鼠BG、BUN、Cr和uAE含量較模型組也均顯著降低(P<0.05)。

4.5 各實驗組小鼠腎臟足細胞自噬的透射電鏡觀測結果

實驗結果如圖5所示。從圖5A可見，正常組小鼠腎臟足細胞可見較多自噬體及凋亡小體，表明正常情況下，腎臟足細胞自噬程度較高；DN發(fā)生時，足細胞自噬體和凋亡小體明顯減少；而大黃素作用后，小鼠腎臟足細胞自噬體及凋亡小體明顯增多，如圖5D、5E所示，表明大黃素口服可顯著促進DN小鼠腎臟足細胞自噬。Glim組小鼠腎臟足細胞也能觀測到少量自噬體，但和模型組比較無明顯變化(見圖5C)。

圖4 各實驗組小鼠腎臟ROS含量Fig.4 ROS content in kidney of mice in each experimental group注：與正常組比較，△ P<0.05；與模型組比較，* P<0.05。Note:Compared with normal,△P<0.05;Compared with model,*P<0.05.

表1 各實驗組小鼠血糖和腎臟BUN、Cr、uAE含量Table 1 Blood glucose and kidney BUN,Cr,uAE contents of mice in each experimental group

4.6 對DN小鼠腎臟miR-21表達的影響

實驗結果如圖6所示。與正常組比較，模型組小鼠腎臟miR-21表達顯著增多(P<0.05)；表明miR-21與DN的發(fā)生呈正相關。與模型組比較，大黃素給藥組小鼠腎臟miR-21表達顯著減少(P<0.05)，提示大黃素可下調(diào)DN小鼠腎臟miR-21的表達。

圖5 各實驗組小鼠腎臟足細胞自噬的電鏡檢測Fig.5 Electron microscope detection of autophagy of kidney podocytes of mice in each experimental group

4.7 各實驗組小鼠腎臟p62、Atg7、LC3蛋白表達

實驗結果如圖7所示。與正常組比較，模型組小鼠腎臟p62、Atg7、LC3蛋白表達顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，大黃素給藥組小鼠腎臟p62、Atg7、LC3蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05)。

5 討論與結論

糖尿病腎病患者及動物模型腎組織中已被證實有氧化應激和凋亡發(fā)生，體外實驗也發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境可誘導足細胞發(fā)生氧化應激、凋亡、炎癥等事件。腎臟足細胞對于維持腎小球濾過屏障的完整性、調(diào)節(jié)腎小球的通透性具有重要作用。在此過程中，腎小球足細胞自噬與糖尿病腎病發(fā)病密切相關。一旦足細胞自噬活性改變，過度激活或者被抑制，都會造成足細胞炎性損傷、濾過屏障受損[8,9]。本實驗中我們也觀察到DN小鼠腎臟足細胞自噬嚴重不足，同時ROS顯著增多，ROS是足細胞線粒體內(nèi)的信號分子，是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展始動的環(huán)節(jié)[10]，減少ROS產(chǎn)生是一種潛在的預防DN 進展的方法。小鼠灌胃給與大黃素以后，我們觀察到腎臟ROS顯著減少，自噬程度得到增強，進而一系列級聯(lián)反應得到改善，如腎臟炎性病理損傷明顯減輕、BUN、Cr和uAE含量顯著降低。因此，通過促進自噬清除高糖誘導的小鼠腎臟ROS可能是大黃素改善DN小鼠的重要機制。同時我們也看到，Glim也可顯著降低DN小鼠BUN、Cr和uAE水平。Glim為磺酰脲類降糖藥物，其作用機制是通過與胰腺β-細胞表面的磺酰脲受體結合而在體內(nèi)均勻、緩慢釋放。同時Glim可增強周圍組織對胰島素敏感性，同時具有改善胰島素抵抗作用，周圍組織對葡萄糖的利用增加，血糖下降明顯。血糖達標后，糖基化終末產(chǎn)物生成減少，對腎臟的損害減輕。

圖6 各實驗組小鼠腎臟miR-21表達Fig.6 MiR-21 expression in mouse kidney of each experimental group注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。Note:Compared with normal,△P<0.05;Compared with model,*P< 0.05.

miR-21作為廣譜基因，已被證實與DN發(fā)病成正相關。國內(nèi)外已有文獻表明，miR-21可通過介導TGF-β/Smad、PTEN/Akt、MMP-S/TIMPS等信號通路參與DN的發(fā)生發(fā)展[11]。自噬方面，也有文獻報道m(xù)iR-21可干預Akt/mTOR信號通路抑制腎臟足細胞自噬而加重DN的發(fā)病[12]。這些證據(jù)都表明，抑制miR-21進而調(diào)控其下游通路是改善DN的有效策略。本研究也看到，DN小鼠較正常組小鼠腎臟miR-21表達顯著上調(diào)，這可能與DN小鼠腎臟自噬減弱有關系。在非DN疾病中，miR-21也被證明通過負調(diào)控自噬參與到肺纖維化、巨噬細胞、缺氧卵圓細胞等生命活動中。大黃素給藥后，DN小鼠腎臟miR-21表達顯著下調(diào)，而自噬抑制得到解除。但大黃素是否直接介導自噬還是通過調(diào)控miR-21介導細胞自噬需要借助靶基因預測分析進行確證，因為也有研究者報道大黃素可通過溶酶體途徑、線粒體途徑調(diào)控自噬，但是否與調(diào)控miR-21有關需要深入研究。

圖7 各實驗組小鼠腎臟LC3、Atg7、p62蛋白表達Fig.7 Expression of LC3,Atg7 and p62 proteins in the kidneys of mice in each experimental group注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。Note:Compared with normal,△P<0.05;Compared with model,*P<0.05.

在自噬機制探索方面，我們檢測了P62、Atg7和LC3三個經(jīng)典的自噬標志性蛋白的表達，這三個蛋白是自噬溶酶體途徑的關鍵成員，而自噬溶酶體途徑在消除、降解受損細胞器、變性蛋白質(zhì)等生物大分子具有重要作用，是細胞的重要修復機制[13]。故我們推測大黃素增強自噬恢復DN小鼠腎臟病理、生理功能可能與自噬溶酶體途徑有關。結果表明，大黃素給藥后DN小鼠腎臟P62、Atg7和LC3三種蛋白表達上調(diào)，提示大黃素可能作用于腎臟足細胞自噬溶酶體途徑對DN小鼠腎臟產(chǎn)生保護作用。