HPLC指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)含量測(cè)定的八角蓮質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

崔譽(yù)文，何 昊，張 麗，李玉澤，黃文麗，張化為，宋小妹

1西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，西安 710021；2陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心/陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，咸陽(yáng)712046

八角蓮為八角蓮屬八角蓮(Dysosmaversipellis(Hance) M.Cheng ex Ying)的干燥根及根莖，在陜西又名八角七，是傳統(tǒng)民間草藥“太白七藥”之一[1]。八角蓮主要分布在湖北、廣西、廣東、江西、四川、貴州、陜西等地，具有清熱解毒、祛瘀止痛、化痰散結(jié)的功效，主治癰腫疔瘡、跌打損傷、毒蛇咬傷、咽喉腫痛、瘰疬[1,2]。八角蓮以鬼臼之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，但因其外觀和藥性與桃兒七、窩兒七相似，故歷代草本記載常有混淆之處。八角蓮以木脂素類(lèi)和黃酮類(lèi)成分為主，如4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素、山柰酚、槲皮素等[3-6]。研究表明，八角蓮具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌消炎等藥理作用[7-12]。值得注意的是，八角蓮有毒，若使用不當(dāng)可導(dǎo)致中毒，表現(xiàn)為惡心、嘔吐、呼吸急促，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡[13-15]。臨床上八角蓮可用于流行性出血熱、尖銳濕疣等治療，表現(xiàn)出較好的藥理作用[16,17]。筆者通過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)八角蓮質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研究尚不完整，對(duì)其化學(xué)成分的測(cè)定方法和指紋圖譜研究尚淺。因此，為進(jìn)一步完善八角蓮質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，本研究參考相關(guān)研究[18-20]，通過(guò)建立八角蓮HPLC指紋圖譜，測(cè)定其5個(gè)化學(xué)成分的含量，以期為八角蓮的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；舒美KQ-500DE型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限責(zé)任公司)；KEWE電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興有限公司)；GB204電子分析天平(瑞士梅特勒托利多公司，精度0.01 mg)；101-A4型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；DYF-200A型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(上海比朗儀器有限公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品(+)-tanegool-7′-methylether、山柰酚葡萄糖苷、4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素葡萄糖苷、槲皮素、鬼臼毒素、鬼臼毒酮、山柰酚均由本課題組自制，純度經(jīng)高相液相色譜按面積歸一化法測(cè)定均大于98%，符合定量要求。甲醇、磷酸均為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；其余所用試劑均為分析純(天津市天力化學(xué)有限公司)；實(shí)驗(yàn)水為娃哈哈純凈水；八角蓮藥材由課題組采挖或購(gòu)買(mǎi)于四川、廣西、湖北、貴州、云南等省區(qū)。經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為小檗科植物八角蓮Dysosmaversipellis(Hance) M.Cheng ex Ying的干燥根及根莖。各產(chǎn)地藥材鮮品采收或購(gòu)買(mǎi)后50 ℃烘干，除去雜質(zhì)，備用。16批藥材樣品來(lái)源見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Thermo HyPURITY C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm；流動(dòng)相：流動(dòng)相甲醇(A)- 0.4%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～13 min，35%→40% A；13～20 min，40%→43% A；20～40 min，43%→45% A；40～50 min，45%→49% A；50～55 min，49%→54% A；55～56 min，54%→60% A；56 min～70 min，60% A；70～80 min，60%→70% A)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm；進(jìn)樣量：10 μL。八角蓮化學(xué)對(duì)照品及供試品HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 八角蓮藥材樣品來(lái)源Table 1 Sources information of 16 samples

2.2 溶液的制備2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取(+)-tanegool-7′-methylether、山柰酚葡萄糖苷、4′-去甲基鬼臼毒素、鬼臼毒素葡萄糖苷、槲皮素、鬼臼毒素、鬼臼毒酮、山柰酚的對(duì)照品適量，置同一量瓶中，用80%甲醇溶解并定容成質(zhì)量濃度分別為0.154、0.103、0.754、0.840、0.219、5.04、0.146、0.446 mg/mL的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取八角蓮藥材粉末(過(guò)5號(hào)篩)1.0 g，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱(chēng)重，超聲(250 W，60 kHz)45 min，放冷，再稱(chēng)重，用80%甲醇補(bǔ)足減失的量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液，即得。

圖1 混合對(duì)照品(A)及供試品(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A) and samples (B) 注：11.(+)-Tanegool-7′-methylether；15.山柰酚葡萄糖苷；17.4′-去甲基鬼臼毒素；19.鬼臼毒素葡萄糖苷；20.槲皮素；22.鬼臼毒素；23.鬼臼 毒酮；24.山柰酚。Note:11.(+)-Tanegool-7′-methylether;15.Kaempferol-3-O-β-D-glucoside;17.4′-demethylpodophyllotoxin; 19.Podophyllotoxin-4-O-β-D-glucoside;20.Quercetin;22.Podophyllotoxin;23.Podophyllotoxone;24.Kaempferol.

2.3 指紋圖譜

2.3.1 方法學(xué)考察

2.3.1.1 精密度試驗(yàn)

分別取八角蓮(B8)樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，均以鬼臼毒素為參比峰，測(cè)得八角蓮28個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于1%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取八角蓮(B8)樣品溶液，在室溫放置0、2、4、8、12、24 h后分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積值，以鬼臼毒素為參比峰，測(cè)得八角蓮28個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于1%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取八角蓮(B8)樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法分別平行制備6份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積值，以鬼臼毒素為參比峰，測(cè)得八角蓮28個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于1%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.2 指紋圖譜建立

取16批八角蓮不同產(chǎn)地的藥材樣品，每份約1.0 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄HPLC色譜圖，將16批八角蓮樣品的色譜圖導(dǎo)入中國(guó)藥典委員會(huì)開(kāi)發(fā)的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012版)軟件進(jìn)行分析，以廣西八角蓮(B1)的指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，以中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.4 s，經(jīng)多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配后生成八角蓮藥材指紋圖譜的共有模式，見(jiàn)圖2。

圖2 16批次八角蓮的指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 16 batches of the root of D.versipellis

2.3.3 共有峰的標(biāo)定

根據(jù)16批八角蓮藥材的指紋圖譜的檢測(cè)結(jié)果，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)體系》(2012版)的數(shù)據(jù)匹配功能，在對(duì)照指紋圖譜上標(biāo)定共有峰，八角蓮HPLC指紋圖譜中共有28個(gè)共有峰，見(jiàn)圖3。通過(guò)HPLC將各對(duì)照品的保留時(shí)間與各藥材的指紋圖譜對(duì)照，共指認(rèn)了其中的8個(gè)共有峰，分別為 (+)-tanegool-7′-methylether(11號(hào)峰)、山柰酚葡萄糖苷(15號(hào)峰)、4′-去甲基鬼臼毒素(17號(hào)峰)、鬼臼毒素葡萄糖苷(19號(hào)峰)、槲皮素(20號(hào)峰)、鬼臼毒素(22號(hào)峰)、鬼臼毒酮(23號(hào)峰)和山柰酚(24號(hào)峰)。選擇出峰時(shí)間適中、峰面積較大、對(duì)稱(chēng)性較好的鬼臼毒素色譜峰(22號(hào)峰)作為參照峰(S)，以參照峰的保留時(shí)間和峰面積作為1，分別計(jì)算其他各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

圖3 八角蓮HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig.3 HPLC of common models fingerprint of the root of D.versipellis注： 11.(+)-Tanegool-7′-methylether；15.山柰酚葡萄糖苷；17.4′-去甲基鬼臼毒素；19.鬼臼毒素葡萄糖苷；20.槲皮素；22.鬼臼毒素；23.鬼臼 毒酮；24.山柰酚。Note:11.(+)-Tanegool-7′-methylether;15.Kaempferol-3-O-β-D-glucoside;17.4′-demethylpodophyllotoxin; 19.Podophyllotoxin-4-O-β-D-glucoside;20.Quercetin;22.Podophyllotoxin;23.Podophyllotoxone;24.Kaempferol.

表2 八角蓮共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Table 2 Relative retention time of common peak

續(xù)表2(Continued Tab.2)

表3 八角蓮共有峰的相對(duì)峰面積Table 3 Relative retention area of common peak

續(xù)表3(Continued Tab.3)

2.3.4 相似度評(píng)價(jià)

將各個(gè)批次的八角蓮指紋圖譜分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件，對(duì)各批次樣品的指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。八角蓮與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度除B10(湖南)、B14(湖北)、B15(湖北)外，其他均在0.9以上。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 八角蓮樣品與生成的對(duì)照?qǐng)D譜的相似度Table 4 Similarity of 16 batches of samples

圖4 16批藥材指紋圖譜聚類(lèi)分析的樹(shù)狀圖Fig.4 Dendrogram of fingerprint clustering analysis of 16 batches of samples

2.3.5 系統(tǒng)聚類(lèi)分析

分別將16批八角蓮樣品的HPLC指紋圖譜中各自的共有峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用組間聯(lián)接法，以歐式平方距離對(duì)樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，16批八角蓮大致分為兩類(lèi)，I類(lèi)包括S1～S9、S11、S12、S16，各個(gè)批次的樣品相似度較高(0.937 ～0.992)，產(chǎn)地包括湖北、廣西、貴州、四川、云南，II類(lèi)包括S10、S13～S15，各個(gè)批次的樣品相似度較低(0.808～0.907)，產(chǎn)地包括湖南、湖北、云南。

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 線性關(guān)系考察

將“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，以80%甲醇水溶液依次稀釋0、2、4、8、16、32倍，制成系列混合對(duì)照品溶液，吸取上述混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，得5種成分的回歸方程。結(jié)果表明，5種成分線性關(guān)系良好(見(jiàn)表5)。

表5 5種成分線性關(guān)系結(jié)果Table 5 Results of linear ranges of 5 constituents

2.4.2 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液(B8)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，測(cè)得(+)-tanegool-7′-methylether、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、鬼臼毒素、山柰酚峰面積的RSD(n=6)均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液(B8)，分別于0、4、8、12、16、20、24 h按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積值，測(cè)得(+)-tanegool-7′-methylether、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、鬼臼毒素、山柰酚峰面積的RSD(n=6)均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批次(B8)的藥材粉末6 份，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積值，測(cè)得(+)-tanegool-7′-methylether、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、鬼臼毒素、山柰酚的平均含量分別為0.824、6.16、0.807、31.6、1.80 mg/g，峰面積的RSD(n=6)均小于3%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量(B8)的樣品粉末6份，每份約0.5 g，精密稱(chēng)定，分別加入一定量對(duì)照品，按照“2.2.1”項(xiàng)下的方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果(+)-tanegool-7′-methylether、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、鬼臼毒素、山柰酚的平均回收率分別為98.2%、99.5%、99.4%、99.6%、98.7%，RSD均小于3%(見(jiàn)表6)。

表6 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of recovery test

續(xù)表6(Continued Tab.6)

2.4.6 樣品含量測(cè)定

分別精密稱(chēng)取不同批次的八角蓮樣品約1.0 g，每個(gè)樣品平行2份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各樣品中(+)-tanegool-7′-methylether、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、鬼臼毒素、山柰酚的含量。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)Table 7 Results of the samples content determination(n=2) (mg/g)

續(xù)表7(Continued Tab.7)

2.4.7 耐用性試驗(yàn)

2.4.7.1 色譜柱考察

精密稱(chēng)取樣品(編號(hào)：B8)適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別設(shè)置色譜柱Thermo HyPURITY C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters SunFire C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Inertsil ODS-3 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，詳見(jiàn)表8。結(jié)果表明，色譜柱發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿(mǎn)足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

2.4.7.2 流速考察

精密稱(chēng)取樣品(編號(hào)：B8)適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，流速分別設(shè)置為0.8、1.0、1.2 mL/min，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知，流速發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿(mǎn)足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

2.4.7.3 檢測(cè)波長(zhǎng)考察

精密稱(chēng)取樣品(編號(hào)：B8)適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)分別設(shè)置為285、290、293 nm進(jìn)樣測(cè)定，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，詳見(jiàn)表8。結(jié)果表明，檢測(cè)波長(zhǎng)發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿(mǎn)足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

2.4.7.4 柱溫考察

精密稱(chēng)取樣品(編號(hào)：B8)適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，柱溫分別設(shè)置為20、25、30 ℃，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，詳見(jiàn)表8。結(jié)果表明，柱溫發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿(mǎn)足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

表8 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Results of content determination of samples

3 討論

本研究對(duì)八角蓮檢測(cè)的色譜條件進(jìn)行了選擇及優(yōu)化，分別考察了甲醇/水、乙腈/水、甲醇/磷酸水、乙腈/磷酸水不同比例洗脫溶劑對(duì)HPLC色譜圖的影響，結(jié)果顯示甲醇-0.4%磷酸水為較優(yōu)溶劑；并結(jié)合全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示290 nm下色譜峰的數(shù)量較多，峰面積較大且分離度較好，故選擇290 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)；另對(duì)提取方式(回流和超聲)，提取溶劑(水、乙醇、甲醇)等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)以甲醇超聲(250 W，60 kHz)提取效果最優(yōu)。該方法簡(jiǎn)潔方便，易于操作，還可減少對(duì)色譜儀的損耗，準(zhǔn)確測(cè)定八角蓮藥材中的5個(gè)指標(biāo)成分。

指紋圖譜中28個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于1.0%，表明本文建立的指紋圖譜研究方法為一種穩(wěn)定的共有模式，可以作為八角蓮藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)的方法。16批樣品相對(duì)峰面積RSD值較大，說(shuō)明各批樣品間組分含量差異較大，提示八角蓮的品質(zhì)與其產(chǎn)地密切相關(guān)，需對(duì)八角蓮化學(xué)成分進(jìn)行含量測(cè)定，闡明藥材品質(zhì)與產(chǎn)地之間的關(guān)系，為臨床使用八角蓮提供依據(jù)。

從相似度分析結(jié)果可知，相似度除B10(湖南)、B14(湖北)、B15(湖北)外，其他均在0.9以上，說(shuō)明不同產(chǎn)地的八角蓮藥材存在差異，但是其質(zhì)量具有一致性。同時(shí)從聚類(lèi)分析結(jié)果可知，16批八角蓮藥材聚為兩類(lèi)，區(qū)域特征不明顯，與相似度分析結(jié)果相一致，說(shuō)明八角蓮藥材質(zhì)量穩(wěn)定。

從含量測(cè)定結(jié)果可知，不同產(chǎn)地的八角蓮藥材的主要化學(xué)成分有鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、山柰酚，各個(gè)成分含量差異較大，說(shuō)明不同產(chǎn)地八角蓮藥材質(zhì)量差異較大，這可能與藥材的生長(zhǎng)環(huán)境差異和不同采收時(shí)期有關(guān)，單純測(cè)定1～2種成分的含量不能有效反應(yīng)藥材的質(zhì)量，需要對(duì)八角蓮的多種成分同時(shí)測(cè)定，才能全面的反應(yīng)其內(nèi)在質(zhì)量。

八角蓮是我國(guó)特有的瀕危藥用植物，已列入國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物，同時(shí)也是秦嶺“太白七藥”中重要的代表藥物之一，在民間藥用歷史悠久，然而其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未完整制定。本研究建立了八角蓮指紋圖譜研究，并對(duì)其5種成分進(jìn)行了含量測(cè)定，為今后八角蓮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定依據(jù)。