ATP1A1基因在腫瘤中的功能及治療應用研究進展

馮曉異，李蓉濤

1昆明理工大學生命科學與技術學院；2云南中醫藥大學基礎醫學院，昆明 650500

2018年世界衛生組織對腫瘤流行病學調查顯示，全球已面臨老齡化及惡性腫瘤發病率逐年上升的問題[1]，人口老齡化指數越高的國家癌癥發病率越高，肺癌依舊是發病率(11.6%)和死亡率(18.4%)第一的惡性腫瘤。消化系統腫瘤，如結腸癌(9.2%)、胃癌(8.2%)、肝癌(8.2%)等位居全球惡性腫瘤發生率第五位，死因第三位，已成為嚴重危害人類健康的惡性疾病之一。我國是全球癌癥發病率(21%)和死亡率(24%)最高的國家。不同的癌癥雖然病因及癥狀存在差異，但臨床和病理組織觀察均表現出pH梯度失調、代謝紊亂、腫瘤細胞迅速生長及轉移的特征[2]。

Na+/K+-ATPase(NKA)是鑲嵌在細胞膜磷脂雙分子層之間的一種通道蛋白，具有ATPase活性，每消耗一分子ATP可將3個Na+泵出而泵入2個K+，以保持細胞高鉀狀態，維持細胞內外滲透壓、膜電位穩態，產生動作電位，促進系統體液平衡[3-7]。NKA由4個α、3個β亞單位及γ亞型組成[8-10]，α亞基有α1、α2、α3、α4亞型，相對分子量110～130kDa，包括ATP、CTS、Na+、K+等配體的結合位點。α亞基的N端和C端均位于胞內，通過10個跨膜螺旋區定位于質膜上[11](圖1)，α亞基在不同組織中特異性表達，其中α1亞型(ATP1A1)在真核細胞中廣泛表達，α2、α3亞型主要表達于神經組織、心肌細胞等，α4亞型主要在睪丸中表達。α1亞基是一個具有Mg2+、ATP、Na+、K+和哇巴因結合位點的催化亞基；β亞基為調節性糖蛋白，在α亞基的合成、穩定性和轉運中起著重要作用；γ亞基屬于相對分子質量為6.5～10 kDa的單次跨膜FXYD蛋白家族，可通過與α羧基末端相互作用，調節NKA與底物的親和力[12]。近期研究發現[13]，NKA基因的某些突變可能會比離子泵功能失活引起更大的生理擾動，這種生理擾動可能是通過使離子通道泄漏、蛋白質不穩定或錯誤折疊等方式產生。

圖1 Na+/K+-ATPase結構與α-亞單位結構示意圖Fig.1 The general structure of Na+/K+-ATPase and alpha subunits注：α亞基上具有用于離子傳輸的催化域(A，P和N結構域)；A：執行結構域；P：磷酸化結構域；N：核酸結合結構域。Note:The α-subunit carries all the catalytically domains (Domain A,P,and N) for ion transport;A:Actuator domain;P:Phosphorylation domain;N:Nucleotide binding domain.

NKA在主動轉運、能量代謝、信號傳遞等方面都發揮著重要作用[14-17]，其中信號轉導作用主要歸因于α亞基[18]。在各種腫瘤中ATP1A1的表達具有顯著差異性[5,19,20]，調節ATP1A1基因的表達對抑制腫瘤進展具有積極的作用。本文就ATP1A1基因在不同腫瘤中的表達情況、參與信號轉導機制及目前以ATP1A1為靶點的治療應用進行綜述，以期為后續研究提供參考。

1 ATP1A1基因在腫瘤中的表達差異性

缺氧是腫瘤微環境的主要特征之一，NKA活性降低加重腫瘤組織缺氧程度并參與維持癌細胞異常的pH梯度[21,22]，缺氧和細胞外酸化又使NKA離子泵活性進一步降低。研究發現，ATP1A1在多種癌細胞中過表達，如乳腺癌[23]、肺癌[24,25]、肝癌[26]、膠質瘤[27]等。其中乳腺癌患者ATP1A1過表達與乳腺癌患者生存率低密切相關。相對于ATP1A1過表達的乳腺癌患者，ATP1A1低表達的乳腺癌患者具有更長的生存期，抑制ATP1A1的表達具有抑制腫瘤生長，延長乳腺癌患者生存期的作用[23]。Mijatovic等[24]對非小細胞肺癌(NSCLC)的臨床樣本研究顯示，66%的樣品中α1亞基過表達，α2和α3亞基在正常肺組織和NSCLCs中表達無差異，提示NKA信號轉導功能的失調主要因α1亞基的表達改變所導致。沉默或抑制ATP1A1基因的表達可顯著抑制癌細胞的增殖和遷移能力。惡性神經膠質瘤是復發率和死亡率最高的中樞神經系統疾病之一，ATP1A1-siRNA的轉染實驗證實[28]，鈉泵抑制劑在治療人腦膠質瘤中具有積極作用，抑制ATP1A1可能是人類神經膠質瘤的潛在治療方法。

與之相反，在某些腫瘤中ATP1A1基因呈現低表達現象，如結直腸癌[10,29]、前列腺癌[30]、腎癌[31]等。Sakai等[10]發現與正常粘膜細胞相比，結直腸癌患者腫瘤組織中NKA活性顯著降低，α1亞基表達下降，α3亞基表達水平升高，提示ATP1A1表達的減少和α3亞基的增加可能與結直腸癌的發生和發展有關。這一結論在de Souza等[29]的研究中也得到證實，并發現NKAα1和β1亞基下調和ERK 1/2激活是相互關聯的，這種關聯引起了直腸癌細胞粘附性的喪失，而這種細胞粘附性的降低對直腸癌的發展起到關鍵作用。在前列腺癌的研究中[30]發現，正常前列腺和前列腺增生上皮細胞中α1亞型豐富，但晚期癌細胞中α1亞型卻明顯降低，說明ATP1A1表達的減少可能與前列腺的發展有關。同樣，在腎癌細胞中[31]ATP1A1基因表達高低與腎癌(RCC)患者的生存情況也有相關性，ATP1A1低表達與RCC的生存期短相關，提高ATP1A1的表達具有明顯延長RCC患者生存時間的作用[32,33]。

ATP1A1基因的異常表達廣泛存在于各種腫瘤細胞中，其表達水平的高低與患者生存期長短相關，而在不同類型的腫瘤中ATP1A1基因表達體現出了細胞之間的差異性，這種表達的差異性與腫瘤類型的關系，以及其發生機制及意義尚未闡釋，值得進一步深入的研究[34]。

2 ATP1A1參與信號轉導的分子機制

NKA是質膜上一種廣泛表達的膜蛋白，但只有約30%的質膜NKA行使離子泵功能，大部分NKA參與了依賴于酪氨酸激酶(Src)的細胞信號轉導，其中α亞基為主要參與者[35]。α1亞基第二個胞漿結構域(CD2)與Src激酶結構域(SH2)相結合，穩定Src激酶處于無活性狀態，α1亞基的任何改變，都將打破這一穩態，從而誘發細胞內信號轉導，而其他α亞基均無此功能[35-37]，因此，NKA的信號轉導功能主要歸因于α1亞基。

2.1 NKAα1亞基介導的信號轉導

每個正常組織的上皮細胞約表達一百萬個α1亞基，數量大概是Src的五倍。因此，α1亞基至少可以通過兩種方式調節細胞活性：首先，可以結合并保持Src處于非活化狀態。當敲除一個拷貝的ATP1A1基因會導致α1亞基的表達降低20%～30%，致使Src和ERK活性提高至少1倍[38]；其次，Na+/K+-ATPase-Src復合物上有強心類固醇激素結合位點，可調節細胞信號[39]。ATP1A1與Src的相互作用存在著爭議，據報道，Src可以與NKA亞基的胞內域結合，從而調節下游蛋白質和細胞功能[40]。相反，也有報道稱ATP1A1通過與Src結合而抑制Src活化[41]。

當ATP1A1基因減少或類固醇激素與α亞基結合，破壞了Src穩態，Src發生418位點的自磷酸化而被激活，激活的Src可與表皮生長因子受體(EGFR)結合，啟動激酶級聯信號轉導，導致磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、Ras/Raf/ERK、ERK1/2和PLC/PKC的隨后激活；同時可以促使線粒體產生大量的ROS，調節胞內Ca2+濃度，激活第二信使[42]，調控細胞的增殖、分化及凋亡[43](圖2)。無論Src活性升高還是降低，與α1亞基相互作用的改變，都會改變Src信號傳導，最終影響細胞的增殖和代謝。

圖2 依賴Na+/K+-ATPaseα1介導的Src激酶信號通路在正常細胞和癌細胞中的調節示意圖Fig.2 Schematic diagrams of α1 Na+/K+-ATPase-mediated Src regulation in normal and cancer cells

2.1.1 PI3K信號通路

PI3K信號通路通過激活蛋白激酶B(Akt)將信號傳遞到下游不同的靶點，包括mTOR的激活(影響p70或4EBP1的轉錄)，從而在細胞增殖、存活、遷移、自噬、血管新生等眾多生理過程發揮作用。PI3K/AKT途徑是控制細胞增殖、存活的主要途徑之一，也是經典Ras通路之一。當Ras介導的AKT信號轉導受到抑制時，PI3K途徑被ATP1A1激活，調控細胞增殖和生長，用特定的Src抑制劑治療神經膠質瘤細胞時可顯著抑制癌細胞的遷移和增殖[44]。研究證實，敲除ATP1A1可以降低Src激酶Tyr416的磷酸化，導致Src活性受到抑制[45]，從而進一步抑制基于Src活化的信號轉導。ATP1A1基因過表達的膠質瘤細胞中，敲除ATP1A1基因可在不影響Akt表達水平的條件下，抑制Akt蛋白的磷酸化，負調控PI3K-Akt-mTOR通路，從而誘導自噬的發生[43]，調節NKA在質膜上的密度及分布。

2.1.2 MAPK信號通路

MAPK超家族包括3個亞家族，即MAPK/JNK、p38MAPK及ERK1/2。Snhematorova等[46]對MAPK信號通路在巴頓病的分子機制研究中發現，由于ATP1A1蛋白質三級結構的錯誤折疊導致Src激酶活性的失調，發生自發性和重復激活，而激活的EGFR，隨后導致MAPK的級聯。ERK 1/2活化可增加細胞cyclinDl蛋白活性和基因表達，cyclinDl蛋白是G1向S期轉換的正性調控因子，cyclinDl的過度表達可導致細胞異常增殖[47]，ERK 1/2的激活可誘導癌細胞的大量增殖。在ATP1A1基因低表達的腎癌細胞中，通過轉染ATP1A1表達質粒，腎癌細胞中磷酸化的MEK和ERK蛋白在轉染細胞中表達量顯著降低(約為50%)。這說明對于低表達ATP1A1基因的癌細胞來說，提高ATP1A1基因表達或抑制NKA離子泵活性均可以起到抑制Raf/MEK/ERK活化的作用，從而抑制細胞增殖及分化[28,30]。

2.1.3 PKC信號通路

PKC是腫瘤細胞活化的重要信號分子，參與細胞增殖、分化、凋亡及腫瘤生成等過程[48]。為了探討PKC與NKA活性的關系，研究者[49]采用PKC抑制劑處理腎癌細胞(Caco2)，發現PKC通路被抑制的同時NKA活性顯著降低。Sottejeau等[48]的研究表明，ATP1A1亞基參與了PKC介導的離子轉運調節，PKC調節NKA進出質膜的循環，PKC的激活可影響網格蛋白所介導的內吞作用，從而影響NKA在質膜中的分布，調節NKA的活性。研究證實,NKAα1亞基16位和23位絲氨酸的磷酸化是PKC活化NKA的活化位點，NKA的活化繼而又使PKC進一步激活[50]。

2.2 NKA α1介導的細胞內吞

細胞內吞是細胞與外界物質交流至關重要的過程，包括網格蛋白和非網格蛋白介導的內吞作用，涉及到細胞極性、遷移、分裂等[51]。EGFR是位于細胞質膜上的跨膜糖蛋白，屬于酪氨酸激酶受體，激活的Src與EGFR結合，導致EGFR的反式激活，誘導網格蛋白介導的細胞內吞。Lingemann等[52]最新研究發現，肺合胞病毒(RSV)感染與ATP1A1信號激活密切相關，ATP1A1的激活導致EGFR的反式激活，誘發肌動蛋白重排和質膜皺褶，膜的延伸將RSV吞噬到囊泡中，RSV以包膜的形式進入宿主細胞，其機制不依賴病毒轉錄和基因組或病毒復制。降低ATP1A1基因的表達，抑制Src-EGFR信號的激活，可顯著降低RSV感染效率(圖3)。

圖3 ATP1A1依賴性RSV進入細胞的模式圖Fig.3 Proposed model of ATP1A1-dependent macropinocytic entry of RSV

3 ATP1A1基因表達與腫瘤細胞增殖、凋亡的關系

NKAα1亞基參與的上述細胞信號轉導，涉及到了細胞增殖、分化、遷移、凋亡、腫瘤形成等過程[53,54]。對于ATP1A1過表達的腫瘤細胞，α1亞基在細胞膜上的分布顯著提高，ATP1A1的敲除或沉默可以減少Src激酶級聯激活，下調Akt和ERK1/2磷酸化，從而有效抑制細胞的增殖和生長。將人類肝癌細胞的ATP1A1基因沉默或抑制的實驗結果顯示，抑制cyclin依賴性激酶2(CDK2)的表達，細胞產生S期阻滯，細胞的增殖能力和遷移能力降低，同時細胞內Ca2+和ROS的增加，而過度產生的 ROS 導致 DNA 的氧化損傷，從而引發細胞凋亡[28]。因此，對ATP1A1過表達的腫瘤來說，抑制ATP1A1基因的表達，具有延長生存期的作用[55]。

對于ATP1A1低表達的腫瘤，NKA離子泵功能降低，導致細胞內H+與細胞外部的Na+跨膜交換減少，胞外pH降低，呈現弱酸性。臨床研究發現，ATP1A1陽性的腎癌患者比ATP1A1陰性的患者有更長的生存時間。外源ATP1A1基因的引入可增加線粒體ROS的產生，導致DNA損傷，抑制腎癌細胞增殖和細胞遷移，誘導細胞凋亡的發生[32]。在前列腺癌中NKA下調降低了離子泵的活性，及Src相關的信號轉導，α1亞基類似多肽pNaKtide的導入，可以降低Src激酶活性，從而誘導細胞凋亡，阻止體內癌細胞增殖[17]。

可見α1亞基在不同腫瘤細胞中的特異性表達與其所行使的功能，存在著復雜的聯系，正常細胞和惡性細胞的NKA活性不同，可能是由于腫瘤細胞質膜NKA的密度改變以及同工酶表達的差異所致。這種轉變的分子機制尚不清楚，是一個值得進一步研究的課題。

4 以ATP1A1為靶點的藥物開發及臨床應用

α1亞基在信號轉導和NKA活性調節中所表現出來的雙重作用，為以ATP1A1為靶點的藥物研究與開發提供了依據。脊椎動物體內可產生內源性強心劑類固醇[18]，如哇巴因，但在生理條件下含量很低，故其濃度變化不會導致離子濃度的擾動，但可以引發信號級聯[56]。強心苷類物質[57]通過抑制NKA的信號轉導來發揮作用，如誘發自噬、促進細胞凋亡等方式發揮抗癌作用[58]。低濃度的強心苷，包括哇巴因，地高辛和洋地黃毒苷，可以在不影響NKA活性的情況下阻斷癌細胞的生長，通過體積調節陰離子通道(volume-regulated anion channel，VRAC)和NKA之間的相互作用介導強心苷誘導的信號傳導，刺激活性氧的產生，激活VRAC，VRAC電流增強，并伴隨著癌細胞增殖的減少[59]。Lan等[60]對華蟾素的主要成分蟾毒靈抗膠質母細胞瘤的研究顯示，蟾蜍靈可誘導膠質母細胞瘤細胞凋亡和氧化應激，并引發DNA損傷，通過激活泛素-蛋白酶體信號通路顯著抑制膠質母細胞瘤細胞中ATP1A1的表達，促進ATP1A1蛋白的降解，并顯著抑制腫瘤的生長，進一步證實了ATP1A1在人膠質瘤抗癌作用中的關鍵作用，調節的ATP1A1和p53信號介導的線粒體凋亡途徑的療法可能是人類神經膠質瘤的潛在治療方法。目前多種NKA抑制劑已開展臨床研究(表1)，其中地高辛(digoxin)、安維澤爾(anvirzel)和華蟾素等藥物的I和II期臨床試驗結果顯示，單獨或與其他抗癌劑的聯合使用，NKA抑制劑均具有良好的安全性，但療效有限，需要進一步推進隨機臨床試驗以證實強心苷類物質治療癌癥的有效性和安全性。尋找或開發具有NKA調節活性的抗癌藥物也值得深入研究。

表1 Na+/K+-ATPase抑制劑抗癌作用的臨床研究Table 1 Clinical study of anti-cancer effect of Na+/K+-ATPase inhibitor

續表1(Continued Tab.1)

ATP1A1基因在不同腫瘤中表達具有顯著性差異，作為信號轉導的主要參與者，闡釋其發生機制及意義對開發具有NKA調節功能的抗腫瘤藥物具有重要的意義。近些年許多國內外學者通過敲除或沉默ATP1A1對其抗癌活性機制進行了大量研究，但其作用機制復雜，涉及到不同腫瘤中ATP1A1基因表達的特異性，且目前關于ATP1A1在穩定Src和激活Src方面存在爭議。因此，在今后的研究中，需要進一步闡釋ATP1A1基因表達特異性在腫瘤中的發生機制，構建腫瘤模型以闡釋α1-Src相互作用的確切機制和直接證據。