外源H2S對滲透脅迫下裸燕麥種子萌發和幼苗生長的影響

劉建新，劉瑞瑞，賈海燕，卜 婷，李 娜

(甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室/隴東學院生命科學與技術學院, 甘肅 慶陽 745000)

干旱和土壤鹽堿化是世界公認的兩大環境問題，并成為限制農作物生長發育和產量提高的重要非生物脅迫因素。種子萌發是植物完成生活史的起始階段，也是農業上保證播種出苗和后期生長發育的前提。裸燕麥(AvenanudaL.)為起源于中國的一種禾本科燕麥屬一年生雜糧作物，其籽粒蛋白質和油脂含量高，氨基酸組成均衡[1]，且富含膳食纖維β-葡聚糖及總酚、黃酮、礦物質和維生素等功能性營養成分，因而其被譽為“全價營養食品”[2]，在我國內蒙古、山西、河北、陜西和甘肅等地廣泛種植，播種面積僅次于小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)和水稻(Oryzasativa)[3]。裸燕麥雖然具有較強抗旱和耐鹽堿特性，但干旱和鹽堿造成的滲透脅迫成為裸燕麥種植成苗率低、缺苗斷壟進而影響產量的重要因素[4]。進行播前種子預處理是農業上經常采用的提高種子抗逆性的技術手段，其中浸種是一種操作簡單、便于實施的有效方法[5]。因此，研究滲透脅迫下提高裸燕麥種子活力的適宜浸種劑及其使用濃度對裸燕麥生產具有重要實際意義。

硫化氫(Hydrogen sulfide, H2S)是近年來在植物體內發現的第3種氣體信號分子，它參與植物生長發育和生理代謝過程調控，能夠增強植物對干旱[6]、低溫[7]和鹽脅迫[8-10]等多種逆境的抗性。研究表明，H2S在植物種子萌發響應逆境的過程中也發揮著重要的調控作用。如外源H2S能夠激活小麥β-淀粉酶活性，促進其種子萌發[11]；通過增強抗氧化防御能力減輕干旱脅迫對水稻[12]和鹽脅迫對苜蓿(Medicagosativa)[13]種子萌發的抑制；緩解NaCl脅迫下番茄(Lycopersiconesculentum)種子活力的下降[14]；能夠通過誘導抗氧化系統和滲透劑生物合成來提高高溫下玉米種子的萌發和幼苗生長[15]；且能激活貯藏蛋白促進綠豆(Vignaradiata)種子萌發[16]；用H2S供體NaHS處理可提高小麥種子中H2S的含量，并以NaHS劑量依賴方式緩解銅脅迫對小麥種子萌發的抑制[17]等。這些研究證實，外源H2S能夠促進逆境下作物種子的萌發，但不同強度滲透脅迫下外源H2S對作物種子萌發影響的研究迄今尚未見報道。本研究以裸燕麥為試驗材料，以不同濃度聚乙二醇(PEG-6000)模擬滲透脅迫，研究不同濃度NaHS浸種對滲透脅迫下種子萌發和幼苗生長的影響，旨在了解外源 H2S對滲透脅迫下裸燕麥種子活力的影響效應，篩選緩解滲透脅迫適宜的NaHS浸種濃度，以期為利用H2S增強作物在種子萌發期的抗逆性提供理論依據和實踐指導。

1 方 法

1.1 供試材料

試驗于2019年4—7月在甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室進行。供試裸燕麥品種‘定莜9號’種子2017年購自甘肅省定西市農業科學研究院。H2S供體硫氫化鈉(NaHS)購自Sigma-Aldrich公司，PEG購自上海生物工程有限公司。

1.2 試驗設計

采用NaHS濃度和滲透脅迫兩因素試驗設計。NaHS濃度共設4個水平，分別為0、0.2、1.0 mmol·L-1和5.0 mmol·L-1；滲透脅迫共設5個水平，滲透勢分別為0、-0.2、-0.3、-0.4 MPa和-0.5 MPa，對應的PEG質量濃度分別為0、119、149、178 g·L-1和202 g·L-1[18]。兩個因素的不同水平進行完全組合，共計20個處理。試驗前，精選飽滿、大小一致的裸燕麥種子，用體積分數為2%的NaClO表面消毒5 min，用蒸餾水反復沖洗后吸干表面水分，在室溫下分別用濃度為0、0.2、1.0 mmol·L-1和5.0 mmol·L-1NaHS溶液在暗處浸種8 h，然后用蒸餾水洗凈，將各浸種處理的種子均勻播于鋪有兩層濾紙的培養皿(直徑12 cm)中，每皿播種100粒，分別向培養皿中加入預先配制好的上述不同質量濃度的PEG溶液10 mL模擬滲透脅迫。每個培養皿作為1個處理，每個處理重復3次。置于培養箱(LPGZ-250A，無錫萊浦儀器設置有限公司)中20℃、16 h/8 h光/暗培養，光照強度200 μmol·m-2·s-1，每天更換1次處理液。

1.3 測定指標和方法

從種子播種后每12 h觀察1次，以胚根突破種皮2 mm作為發芽標準，記錄種子發芽數，共觀察記錄7 d。第7天結束發芽試驗后，從每個培養皿中隨機選取代表性萌發苗10株用直尺測量胚根和胚芽長，分別計算平均長度；將每個培養皿中胚根、胚芽和籽粒剩余部分各自分開，在電熱恒溫干燥箱中105℃殺青30 min后70℃烘干至恒重，用電子天平分別稱量干重。然后按下列公式計算種子發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數、平均發芽時間、貯藏物質轉運率。

發芽勢=萌發第3天時總的種子發芽數/供試種子數×100%

發芽率=萌發第7天時種子的發芽總數/供試種子數×100%

發芽指數=∑(Gt/Dt)

式中，Gt為第t天的種子發芽數；Dt為相應發芽天數。

活力指數=發芽指數×(胚根+胚芽)干重

平均發芽時間=∑(Dn×n)/∑n

式中,Dn是發芽天數；n為相應各天新發芽的種子數，本試驗最大值為58。

貯藏物質轉運率=[(胚根+胚芽)干重/(胚根+胚芽+籽粒剩余部分)干重]×100%

1.4 數據統計分析

應用Microsoft Excel 2007和SPSS 20.0軟件計算各指標和方差分析，并運用Duncan’s法檢驗差異顯著性(P<0.05)，其中百分數數據先用反正弦平方根轉換(y=arcsin[sqrt(x/100)])后再進行分析，結果以平均值±標準誤差表示。

采用隸屬函數分析方法綜合評價NaHS浸種對滲透脅迫下種子萌發的影響。不同處理平均發芽時間的隸屬函數值計算公式為：

U(Xi)=1-(Xi-Ximin)/(Ximax-Ximin)

發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數、貯藏物質轉運率、胚根長、胚芽長和幼苗干重的隸屬函數值計算公式為：

U(Xi)=(Xi-Ximin)/(Ximax-Ximin)

式中,U(Xi)表示指標Xi的隸屬函數值；Ximin和Ximax分別為第i個指標的最小值和最大值。

每個指標采用客觀賦權法：

Ii=Si/C0i

式中,Si為第i個指標的U(Xi)，C0i是對照組第i個指標隸屬函數值的平均值；每一指標按公式Wi=Ii/∑Ii計算權重；最后計算綜合評價值D=[U(Xi)×Wi][19]。

2 結果與分析

2.1 PEG濃度和NaHS濃度對裸燕麥種子萌發和幼苗生長的雙因素方差分析

表1表明，PEG濃度和NaHS濃度對裸燕麥種子發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數、平均發芽時間、貯藏物質轉運率、胚根長、胚芽長、幼苗干重和綜合評價值D均有顯著影響(P<0.05)；PEG濃度和NaHS濃度的交互作用對發芽指數、活力指數、平均發芽時間和胚根長的影響顯著，對發芽勢、發芽率、貯藏物質轉運率、胚芽長、幼苗干重和D值無顯著影響。

表1 PEG濃度和NaHS濃度對裸燕麥種子萌發和幼苗生長的雙因素方差分析

2.2 外源H2S對PEG滲透脅迫下裸燕麥種子發芽勢的影響

由表2可見，在不同NaHS濃度處理下，隨著PEG濃度提高，裸燕麥種子發芽勢均呈顯著下降趨勢。在PEG濃度為0即H2O培養條件下，與NaHS濃度為0的對照相比，0.2 mmol·L-1和5.0 mmol·L-1NaHS處理的發芽勢差異不顯著，1 mmol·L-1NaHS處理的發芽勢顯著提高；在PEG濃度為119 g·L-1時，0.2 mmol·L-1NaHS處理的發芽勢與對照差異不顯著，1.0 mmol·L-1NaHS處理的發芽勢顯著提高了5.9%，5.0 mmol·L-1NaHS處理的發芽勢則顯著降低了9.8%；在PEG濃度為149 g·L-1時，0.2 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1NaHS處理的發芽勢與對照的差異不顯著，5.0 mmol·L-1NaHS處理的發芽勢較對照降低8.3%，差異顯著；在PEG濃度分別為178 g·L-1和202 g·L-1條件下，0.2 mmol·L-1、1.0 mmol·L-1和5.0 mmol·L-1NaHS處理的發芽勢均與對照無顯著差異。

表2 NaHS浸種對PEG滲透脅迫下裸燕麥種子發芽勢的影響/%

2.3 外源H2S對PEG滲透脅迫下裸燕麥種子發芽率的影響

從表3可知，隨著PEG濃度升高，不同NaHS濃度浸種的裸燕麥種子發芽率均顯著下降。在PEG濃度為0 g·L-1條件下，與0 mmol·L-1NaHS浸種相比，0.2 mmol·L-1和5.0 mmol·L-1NaHS浸種的發芽率無顯著差異，1.0 mmol·L-1NaHS處理的發芽率顯著提高了7.1%。在PEG濃度為119～202 g·L-1條件下，0.2 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1NaHS浸種的發芽率變化不大，5.0 mmol·L-1NaHS浸種的發芽率顯著低于0 mmol·L-1NaHS處理。

表3 NaHS浸種對PEG滲透脅迫下裸燕麥種子發芽率的影響/%

2.4 外源H2S對PEG滲透脅迫下裸燕麥種子發芽指數的影響

表4表明，在不同濃度NaHS浸種下，隨著PEG濃度升高，裸燕麥種子發芽指數均呈顯著下降變化趨勢。在PEG濃度為0～202 g·L-1條件下，與0 mmol·L-1NaHS浸種相比，0.2 mmol·L-1NaHS浸種的發芽指數無顯著變化；1.0 mmol·L-1NaHS浸種的發芽指數不同程度提高，其中在0～178 g·L-1PEG濃度下的發芽指數差異顯著；5.0 mmol·L-1NaHS浸種的發芽指數明顯降低。

表4 NaHS浸種對PEG滲透脅迫下裸燕麥種子發芽指數的影響

2.5 外源H2S對PEG滲透脅迫下裸燕麥種子活力指數的影響

隨著PEG濃度升高，不同NaHS濃度浸種的裸燕麥種子活力指數均顯著下降(表5)。在0～202 g·L-1PEG條件下，與0 mmol·L-1NaHS浸種相比，0.2 mmol·L-1NaHS浸種的活力指數差異不顯著；1.0 mmol·L-1NaHS浸種的活力指數不同程度提高，其中在0～149 g·L-1PEG條件下的活力指數差異顯著；5.0 mmol·L-1NaHS浸種的活力指數呈下降變化趨勢，其中在0～149 g·L-1PEG條件下的下降達到顯著水平。

表5 NaHS浸種對PEG滲透脅迫下裸燕麥種子活力指數的影響

2.6 外源H2S對PEG滲透脅迫下裸燕麥種子平均發芽時間的影響

由表6可見，隨著PEG濃度升高，不同濃度NaHS浸種的裸燕麥種子平均發芽時間均顯著提高。在PEG濃度為0～149 g·L-1時，與0 mmol·L-1NaHS浸種相比，0.2mmol·L-1和1.0 mmol·L-1NaHS浸種的平均發芽時間無顯著差異，5.0 mmol·L-1NaHS浸種顯著提高了平均發芽時間；在PEG濃度為178 g·L-1時，0.2 mmol·L-1NaHS浸種的平均發芽時間與0 mmol·L-1NaHS浸種的差異不顯著，1.0 mmol·L-1NaHS浸種的平均發芽時間顯著降低，5.0 mmol·L-1NaHS浸種的平均發芽時間顯著提高；在PEG濃度為202 g·L-1時，0.2 mmol·L-1和5.0 mmol·L-1NaHS浸種的平均發芽時間與0 mmol·L-1NaHS浸種的差異不顯著，1.0 mmol·L-1NaHS浸種的平均發芽時間顯著降低。

表6 NaHS浸種對PEG滲透脅迫下裸燕麥種子平均發芽時間的影響/d

2.7 外源H2S對PEG滲透脅迫下裸燕麥種子貯藏物質轉運率的影響

隨著PEG濃度升高，不同濃度NaHS浸種的裸燕麥種子貯藏物質轉運率均顯著下降(表7)。在不同PEG濃度下，與0 mmol·L-1NaHS浸種相比，0.2 mmol·L-1NaHS浸種的貯藏物質轉運率差異不顯著；1.0 mmol·L-1NaHS浸種顯著提高了0、149 g·L-1和178 g·L-1PEG條件下的貯藏物質轉運率，而119 g·L-1和202 g·L-1PEG條件下的貯藏物質轉運率變化不大；5.0 mmol·L-1NaHS浸種顯著降低了0、149 g·L-1和202 g·L-1PEG條件下的貯藏物質轉運率，而119 g·L-1和178 g·L-1PEG條件下的貯藏物質轉運率變化不顯著。

表7 NaHS浸種對PEG滲透脅迫下裸燕麥種子貯藏物質轉運率的影響/%

2.8 外源H2S對PEG滲透脅迫下裸燕麥幼苗胚根和胚芽長度的影響

隨著PEG濃度升高，不同NaHS濃度浸種的裸燕麥幼苗胚根和胚芽長度基本均呈顯著下降變化趨勢(表8，表9)。在不同PEG濃度下，與0 mmol·L-1NaHS浸種相比，0.2 mmol·L-1NaHS浸種的裸燕麥幼苗胚根和胚芽長度無顯著差異；1.0 mmol·L-1NaHS浸種提高了幼苗胚根和胚芽長度；5.0 mmol·L-1NaHS浸種對0、119 g·L-1和149 g·L-1PEG條件下的胚根長度及0、119 g·L-1PEG條件下的胚芽長度影響不顯著，而顯著降低了178 g·L-1和202 g·L-1PEG條件下的胚根長度及149 g·L-1、178 g·L-1和202 g·L-1PEG條件下的胚芽長度。

表8 NaHS浸種對PEG滲透脅迫下裸燕麥幼苗胚根長度的影響/cm

表9 NaHS浸種對PEG滲透脅迫下裸燕麥幼苗胚芽長度的影響/cm

2.9 外源H2S對PEG滲透脅迫下裸燕麥幼苗干重的影響

從表10可見，隨著PEG濃度升高，不同NaHS濃度浸種的裸燕麥幼苗(胚根+胚芽)干重均呈顯著下降變化趨勢。在不同PEG濃度下，與0 mmol·L-1NaHS浸種相比，0.2 mmol·L-1NaHS浸種對裸燕麥幼苗干重無顯著影響；1.0 mmol·L-1NaHS浸種顯著提高了0 g·L-1和119 g·L-1PEG條件下的幼苗干重，但對149、178 g·L-1和202 g·L-1PEG條件下的幼苗干重無顯著影響；5.0 mmol·L-1NaHS浸種總體上降低了幼苗干重，其中對0、149 g·L-1和178 g·L-1PEG條件下的幼苗干重影響顯著。

表10 NaHS浸種對PEG滲透脅迫下裸燕麥幼苗干重的影響/g

2.10 外源H2S對PEG滲透脅迫下裸燕麥種子萌發綜合評價值D的影響

從表11可知，隨著PEG濃度升高，不同濃度NaHS浸種的D值顯著下降。在不同PEG濃度下，用0.2 mmol·L-1NaHS浸種的D值與0 mmol·L-1NaHS浸種相比無顯著差異；1.0 mmol·L-1NaHS浸種不同程度提高了D值，增幅分別為16.9%、17.0%、18.0%、25.9%和46.7%，其中對0、119、149 g·L-1和178 g·L-1PEG條件下D值的提升作用顯著；5.0 mmol·L-1NaHS浸種顯著降低了D值，降幅達10.4%～73.3%。

表11 NaHS浸種對PEG滲透脅迫下裸燕麥種子萌發綜合評價值D的影響

3 討 論

種子生理學認為，萌發是起始于吸脹、結束于胚伸出周圍結構的細胞事件[20]，而幼苗生長不屬于種子萌發內容的種子萌發后事件[21]。種子能否成功萌發和正常成苗直接影響著作物的產量，種子萌發期也是作物生活周期中對環境最為敏感和脆弱的階段[22]。在干旱和土壤鹽堿化環境中，滲透脅迫是影響種子萌發和成苗的關鍵因素[4，12-14]。諸多研究表明，隨著滲透脅迫增強，植物種子萌發和幼苗生長受抑程度顯著增強[23-24]。發芽勢、發芽率、發芽指數、平均發芽時間和活力指數等常作為評價種子發芽速度、發芽整齊度和幼苗健壯程度的指標[25]。從種子萌發到幼苗生長主要依靠種子貯藏物質提供能量和合成原料，種子貯藏物質轉運率在一定程度上決定胚根(芽)的生長[26]。本試驗結果表明，PEG濃度對裸燕麥種子發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數、平均發芽時間和貯藏物質轉運率的影響顯著，也對裸燕麥幼苗胚根長、胚芽長和幼苗干重存在顯著影響(表1)。隨著PEG濃度提高，裸燕麥種子發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數和貯藏物質轉運率及幼苗胚根長、胚芽長和幼苗干重均顯著下降，而平均發芽時間表現為顯著增加趨勢(表2-10)。這與陳文榮等[19]在高叢藍莓(Vacciniumcorymbosum)、魏波等[23]在紅花(Carthamustinctorius)和金寧等[24]在黃瓜(Cucumissativus)上的研究結果一致。由此可知，裸燕麥同其他植物一樣，隨著滲透脅迫強度增大，種子萌發和幼苗生長受抑程度顯著增強。這可能與滲透勢降低迅速使種子體內抗氧化酶活性下降[26]，引起活性氧清除能力減弱，細胞膜脂過氧化損傷增強[27]有密切關系。

H2S作為新型氣體信號在植物種子萌發和生長發育逆境響應中發揮著重要作用[11-17]。外施H2S可減輕干旱脅迫下水稻[12]及鹽脅迫下紫花苜蓿[13]和番茄[14]種子的萌發和幼苗生長抑制。但前人的研究主要針對H2S供體濃度對單一濃度脅迫下植物種子活力的影響，而未見H2S對不同強度滲透脅迫下作物種子萌發和成苗影響的研究報道。本試驗發現，外源H2S及其與PEG滲透脅迫的交互作用對裸燕麥種子萌發和幼苗生長產生了不同的影響。H2S供體NaHS濃度對裸燕麥種子發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數、平均發芽時間、貯藏物質轉運率及胚根長、胚芽長和幼苗干重影響顯著；而NaHS濃度和PEG濃度的交互作用對發芽指數、活力指數、平均發芽時間和胚根長存在顯著影響，對發芽勢、發芽率、貯藏物質轉運率、胚芽長和幼苗干重的影響不顯著(表1)。本研究中，在同一PEG滲透脅迫下，用低濃度NaHS (0.2 mmol·L-1)浸種對裸燕麥種子的發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數、平均發芽時間、貯藏物質轉運率、胚根長、胚芽長和幼苗干重無顯著影響(表2-10)。當用1.0 mmol·L-1NaHS浸種時，119～178 g·L-1PEG滲透脅迫下的發芽勢和發芽率雖無顯著改變，但0～178 g·L-1PEG滲透脅迫下的發芽指數、活力指數顯著提高，并不同程度降低了平均發芽時間，提高了貯藏物質轉運率，促進了幼苗生長；而202 g·L-1PEG脅迫下除胚根和胚芽顯著增長及貯藏物質轉運率明顯下降外其余指標均無顯著變化。當用5.0 mmol·L-1NaHS浸種時，同一PEG滲透脅迫下的平均發芽時間顯著增加，而其余各萌發參數和幼苗生長參數均呈下降趨勢。這說明適宜濃度的外源H2S浸種能夠有效提高裸燕麥的種子活力，促進其在滲透脅迫下的種子萌發和幼苗生長。這可能是H2S在種子萌發過程中參與了滲透脅迫信號的轉導，促使相關基因表達[28]或誘導抗氧化系統建立和滲透劑生物合成[12-15]等有關。過高濃度NaHS可能加重滲透脅迫[14]或H2S積累使細胞氧化還原平衡遭受破壞，從而造成氧化損傷[9]，使種子萌發和幼苗生長受抑。這與Zhang等[29]對小麥和李永生等[30]對玉米種子萌發的研究結果類似。

不同發芽指標對滲透脅迫和H2S的響應存在差異，為綜合評價NaHS浸種對滲透脅迫下裸燕麥種子萌發和幼苗生長的影響，采用隸屬函數分析結果顯示，PEG濃度和NaHS濃度均對綜合評價D值有顯著影響，但二者交互作用對D值的影響不顯著(表1)。多重比較結果進一步表明：隨著PEG濃度增大，不同濃度NaHS浸種裸燕麥種子的D值顯著降低(表11)。在同一PEG濃度下，0.2 mmol·L-1NaHS浸種對D值的影響不顯著；1.0 mmol·L-1NaHS浸種顯著提高了0～178 g·L-1PEG (對應滲透勢為0～-0.4 MPa)脅迫下的D值；5.0 mmol·L-1NaHS浸種則使D值降低(表11)。這說明外源H2S對滲透脅迫抑制裸燕麥種子萌發和幼苗生長的緩解作用具有劑量依賴效應，以1.0 mmol·L-1NaHS溶液浸種較為適宜。研究結果可為進一步應用H2S開發新型作物抗滲透劑提供一定參考，而H2S緩解滲透脅迫的作用機制尚需進一步探究。

4 結 論

用不同濃度的外源H2S供體NaHS浸種顯著影響滲透脅迫下裸燕麥種子的活力水平，且這種影響與NaHS濃度、滲透脅迫強度及兩者的交互作用有關。滲透脅迫強度越大、NaHS濃度過高(≥5.0 mmol·L-1)，裸燕麥種子活力下降越明顯；NaHS濃度過低(≤0.2 mmol·L-1)對滲透脅迫下裸燕麥種子活力無顯著影響。用1.0 mmol·L-1NaHS浸種可顯著提高0～-0.4 MPa滲透勢下裸燕麥種子的活力水平，而對-0.5 MPa滲透勢下裸燕麥種子活力的影響不顯著。由此可見，用1. 0 mmol·L-1NaHS浸種可緩解-0.4 MPa以上滲透勢對裸燕麥種子萌發和成苗造成的滲透脅迫抑制，雖不能提高發芽勢和發芽率，但可提高發芽指數和活力指數，通過提高種子貯藏物質轉運促進幼苗生長，并可一定程度縮短發芽時間。因此，在干旱區和鹽堿地裸燕麥生產中用適宜濃度NaHS浸種可加快種子萌發和促進壯苗形成。

致謝：郭婉婷同學在試驗觀察和數據分析中做了大量工作，在此表示感謝。