輪作休耕模式對土壤細菌群落的影響

南麗麗，郭全恩，譚杰輝，康發云

(1. 甘肅農業大學草業學院,甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省農業科學院土壤肥料與節水農業研究所，甘肅 蘭州 730070；3. 甘肅省永靖縣農業技術推廣中心，甘肅 永靖 731600)

黃土高原是中國文明發祥地及主要旱作農業生產區[1]。近年來，由于降雨集中、植被覆蓋度降低、特殊的土壤性質以及人類不合理的利用導致黃土高原水土流失日益嚴重，現已成為國內水土流失最嚴重的區域[2]。水土資源的短缺與流失嚴重制約了黃土高原區的經濟發展，限制黃土區生態恢復和土地生產力提高[3]。為了堅守耕地紅線，保障國家糧食安全，更好地實施“藏糧于地、藏糧于技”戰略，實現節約地下水、保護生態環境的目標，國家提出在部分地區探索試行耕地輪作休耕制度。2016年，將河北省地下水漏斗區、湖南省長株潭重金屬污染區、貴州及云南省石漠化區、甘肅省生態嚴重退化區作為我國的休耕試點區[4]。這對提高我國土壤質量、促進農業提質增效[5]、維護食品安全和保障生態安全[6]均具有重要意義。

已有研究表明，稻麥還田[7]、麥秸還田[8]、綠肥還田[9-10]、耕作方式[11]等能夠顯著改變土壤細菌群落；農田種植制度[12]、耕作方式(如免耕、旋耕、深松)[13]、休耕[14]等對物種多樣性有重要影響。而有關甘肅省生態嚴重退化區輪作休耕模式與技術措施對細菌群落的影響少見報道。為此，本試驗對甘肅省黃土高原半干旱區不同輪作休耕模式下土壤化學性質及細菌群落多樣性進行了研究，從微生物和養分的角度探討黃土高原半干旱地區休耕輪作最佳模式，旨在為該地區農業的可持續發展提供理論依據和技術支持，亦為我國科學推行休耕輪作制度試點工作提供現實參考。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗地位于甘肅省永靖縣新寺鄉大灣峴村(36°00′N，103°12′E)，地處隴西黃土高原丘陵溝壑區，境內山大溝深，土質疏松，水土流失嚴重，屬溫帶半干旱偏旱氣候類型，海拔1 957 m，年均溫度8.7℃，>10℃積溫2 750℃，年均降雨量260 mm，且年際、季節性分布不均，降雨主要集中在7—9月，蒸發量高達1 500 mm。樣地0～20 cm土層的pH值為8.24，全氮、全磷、全鉀、有機質含量分別為1.09、0.15、8.25、3.45 g·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機設計，于2017年5月設置9種輪作休耕模式(表1)，小區面積56 m2(7 m×8 m)，區間距為80 cm，3次重復。豆科綠肥作物豌豆(Pisumsativum)、毛苕子(Iiciavillosa)和箭筈豌豆(Viciasativa)的播種量分別為90、45、70 kg·hm-2，播種深度3 cm，行距30 cm。休耕第3年即2019年9月21日用土鉆在各小區按“S”形路線采取0～20 cm土層土樣，3次重復。土樣混勻后裝入滅菌袋中用冰盒帶回，在-80℃冰箱中保存備用。土樣分為兩份，一份用于土壤化學指標測定，另一份用于土壤微生物總DNA提取。

表1 不同輪作休耕模式

1.3 測定方法

土壤化學指標測定：土壤全氮(total nitrogen，TN)采用凱氏定氮法測定，全磷(total phosphorus，TP)采用HC1O4-濃H2SO4外加熱消煮法(分光光度法)測定，全鉀(total potassium，TK)采用HClO4-HF外加熱消煮法(火焰光度法)測定，速效氮(available nitrogen，AN)采用堿解擴散法測定，速效磷(available phosphorus，AP)采用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定，速效鉀(available potassium，AK)采用NH4OAc浸提(火焰光度法)測定，有機質(organic matter，OM)采用重鉻酸鉀容量法(外加熱法)測定，土∶水為1∶5懸液用pH S-4智能酸度計測定[15]。

土壤總DNA提取及細菌16 SrRNA基因擴增：采用CTAB法對土壤基因組DNA進行提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng·μl-1。以稀釋后的基因組DNA為模板，對細菌16S rRNA基因V4區采用帶Barcode的特異性引物[16](515F和806R)進行PCR擴增，每個樣品3次重復。根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對目的條帶使用Qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產物。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用NovaSeq 6000進行上機測序。對Illumina NovaSeq測序得到的下機數據(Raw PE)進行拼接和質控[17]，得到Clean tags，再進行嵌合體過濾，得到可用于后續分析的有效數據(effective tags)。

1.4 數據分析

利用Uparse軟件對樣品的有效序列進行OTUs聚類(Operational Taxonomic Units，相似度97%以上)，用Mothur方法[18]與Silva軟件的SSUrRNA數據庫[19]進行物種注釋(設定閾值為0.8～1.0)；采用MUSCLE(3.8.31)軟件[20]進行快速多序列比對，最后對測序數據進行標準化處理，采用Qiime(1.9.1)軟件計算Alpha多樣性指數，使用R軟件(2.15.3)繪制稀釋曲線。

用Excel 2003進行數據統計，用SPSS 20.0軟件對數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，用 Duncan 法對數據進行多重比較。用CANOCO 4.0軟件對細菌優勢群落與土壤化學指標間的相互關系進行冗余分析，并采用Monte Carlo置換檢驗計算因子的重要性，其中置換次數設為999次，顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 土壤化學性質

由表2可知，不同輪作休耕模式對土壤全量養分、速效養分、有機質及pH值均有顯著影響(P<0.05)。其中全氮、全磷、全鉀含量的變化范圍分別為3.97～11.97 g·kg-1，0.16～0.26 g·kg-1，9.49～11.08 g·kg-1，全氮含量各處理均顯著高于CK；全磷含量T5和T6處理顯著大于CK，其余處理與CK差異不顯著；全鉀含量T2處理與CK差異不顯著，其余處理均顯著高于CK。各處理速效氮、速效磷、速效鉀含量分別在98.14～124.44 mg·kg-1、0.81～2.62 mg·kg-1、28.85～43.15 mg·kg-1范圍內變化，其中速效氮含量T2處理與CK差異不顯著，其余處理均顯著低于CK；速效磷含量T5和T6處理顯著低于CK，T7處理與CK差異不明顯，其余處理均顯著高于CK；速效鉀含量T5和T6處理顯著低于CK，T1處理顯著大于CK，其余處理與CK差異均不顯著。T1、T2、T6處理的有機質含量與CK差異不顯著，其他處理均顯著小于CK。pH值T1、T6、T7處理與CK差異不顯著，其余處理均顯著低于CK。

表2 各樣地土壤化學性質

2.2 土壤細菌群落豐度與Alpha多樣性分析

由表3可知，通過高通量測序，過濾掉低質量的序列后，CK、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8處理的有效序列分別為78325、80788、79104、77342、81711、82409、83994、78413、81662；OTU數分別為3271、3536、3321、3342、3352、3490、3199、3298、3461。由圖1可知，各樣品文庫的覆蓋度均在98%以上，并結合樣品稀釋曲線均趨于平緩，說明本研究測序數據合理，能夠準確反映出土壤細菌群落的真實信息。不同處理土壤細菌群落豐富度指數(Chao1指數和ACE 指數)T7處理與CK差異不顯著，其余處理均顯著高于CK，且T3處理最大；細菌群落多樣性指數(Simpson和Shannon-wiener指數)各處理間差異不顯著。由圖2可知，所有樣品中共有OTUs數目為2474個，其中CK、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8各處理中所特有的OTUs 數目分別為108、209、116、91、102、111、76、123和115個。

表3 樣品序列數統計、豐富度與多樣性指數Table 3 Sample sequence numbers statistics, richness and diversity index

圖1 樣品稀釋曲線

圖2 土壤細菌OTUs分布花瓣圖

2.3 不同輪作休耕模式土壤細菌群落分布

2.3.1 門水平上的群落組成 由圖 3可知，各處理細菌群落相對豐度從大到小位于前十位的細菌門分別為：變形菌門(Proteobacteria)(26.33%～37.33%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(17.93%～21.43%)、放線菌門(Actinobacteria)(12.42%～19.41%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)(6.98%～10.99%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(6.48%～10.50%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(3.10%～8.95%)、棒狀桿菌門(Rokubacteria)(1.97%～3.53%)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(1.63%～2.37%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)(0.72%～1.17%)、奇古菌門(Thaumarchaeota)(0.18%～1.14%)，共占細菌總數的93.37%～95.85%。其中變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門占細菌總數的81.50%～87.01%，說明這5個門的細菌為優勢菌群。除疣微菌門外，不同處理細菌在門分類水平上相對豐度有一定的差異，其中變形菌門、擬桿菌門T2處理顯著高于CK(P<0.05)，其他處理與CK無明顯差異；酸桿菌門T8處理顯著小于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；放線菌門T1、T2處理顯著低于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；芽單胞菌門T6、T7處理顯著高于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；綠彎菌門T2處理顯著低于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；棒狀桿菌門T2、T6、T8處理顯著小于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不明顯；奇古菌門T8處理最高并顯著大于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；硝化螺旋菌門T1、T5處理顯著大于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著。

圖3 門分類水平下的細菌群落相對豐度

2.3.2 屬水平上的群落組成 由圖4可知，各處理細菌群落相對豐度從大到小位于前十位的細菌屬分別為：鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Adhaeribacter屬、未分類酸桿菌屬、內共生菌屬(Buchnera)、芽生球菌屬(Blastococcus)、黃桿菌屬(Flavisolibacter)、黃曲霉屬(Flaviaesturariibacter)、Gaiella屬、Haliangium屬、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)，其他類群的相對豐度占80.07%～87.70%。除未分類酸桿菌屬外，細菌在屬分類水平上各處理相對豐度有一定的差異。其中鞘氨醇單胞菌屬、Adhaeribacter屬、黃曲霉屬和黃桿菌屬T2處理均顯著高于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；芽生球菌屬T1處理顯著低于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；Gaiella屬T1、T2、T3處理顯著小于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不明顯；Haliangium屬T1、T4處理差異不顯著，且均顯著高于CK(P<0.05)，其他處理與CK差異不顯著；芽單胞菌屬T3、T6、T7、T8處理顯著大于CK(P<0.05)，其余處理與CK差異不顯著；內共生菌屬各處理間無明顯差異。

圖4 屬分類水平下的細菌群落相對豐度

2.4 細菌群落結構與土壤性質的關系

為進一步分析不同土壤環境因子對細菌門水平群落結構的影響，對細菌群落結構與土壤環境因子進行RDA分析(圖5)。結果表明，RDA1、RDA2分別解釋總變異的47.95%和8.49%。其中變形菌門、疣微菌門與速效氮、速效磷、速效鉀、有機質呈正相關，與全磷、全氮呈負相關；放線菌門、綠彎菌門、奇古菌門與全氮、全磷、全鉀呈正相關，與速效氮、速效磷、速效鉀、有機質呈負相關；芽單胞菌門、硝化螺旋菌門、酸桿菌門、棒狀桿菌門與全鉀、pH呈正相關，而擬桿菌門與全鉀、pH呈負相關。置換檢驗的結果顯示(表4)，全氮、全鉀、速效氮是主導細菌群落變化的主要因子。

表4 冗余分析Monte Carlo置換檢驗結果

圖5 細菌群落與土壤環境因子冗余分析

3 討 論

土壤細菌不僅能夠快速、高效地分解與轉化營養物質[21]、影響植物對養分的獲取和土壤肥力，而且細菌群落結構的差異和變化規律能反映土壤現狀及變化趨勢，可用來指示土壤生態功能[22]。通過對不同輪作休耕處理10大優勢菌門分析發現，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門是本研究中的優勢菌門，這一結果與多數學者的研究結果相一致[23-24]。變形菌門是土壤中最主要的細菌類群,其代謝活動是土壤中最主要的細菌活動[25]。

酸桿菌門是嗜酸菌，植被類型會影響其分布[26]，不同休耕輪作模式使土壤pH值下降(pH值由8.24下降為7.26～7.39)，有利于酸桿菌生存。放線菌門是土壤養分供給的主要來源，其產生的孢子能夠抵抗外界不利的環境條件[27]。芽單胞菌門是典型的植物促生菌，通過與植物互作，進行生物固氮，誘導植物分泌植物激素，促進植物生長。綠彎菌具有生態恢復的能力，可以增強土壤中營養物質的吸收[28]，本研究顯示T2處理(伏天深耕)的綠彎菌較低，其余輪作休耕模式均優化了土壤環境。

土壤微生物參與完成土壤中各種復雜的生化反應過程[29]。本研究表明，土壤細菌群落多樣性(Shannon和Simpson)指數無顯著性變化，這是由于樣地具有相同的田間管理模式，表明樣地土壤細菌群落均勻度較高；細菌群落豐富度指數(Chao1和ACE)，除T7處理外，其余輪作休耕模式均高于CK，這是由于不同休耕輪作模式根系分泌物的不同影響了土壤細菌群落多樣性[30]。

大量研究表明，土壤化學性質與土壤微生物關系密切[22,31-32]。本研究中土壤優勢菌門與土壤化學因子都有一定的相關性，其中土壤全氮、全鉀、速效氮含量是主導土壤細菌群落結構產生變化的主要因子，表明不同休耕輪作模式的土壤化學性質不同，改變了微生物物種組成及其結構。

4 結 論

在門分類水平上，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門是黃土高原半干旱區不同輪作休耕模式下土壤的優勢細菌門，占整個細菌類群豐富度的81.50%～87.01%，其中T6處理的豐富度最大為87.01%，T2處理的豐富度最低為81.50%；T1、T5處理顯著升高了硝化螺旋菌門的相對豐度，T2處理顯著提高了變形菌門和擬桿菌門的相對豐度，T6、T7處理顯著增加了芽單胞菌門的相對豐度，T8處理顯著增高了奇古菌門的相對豐度。不同輪作休耕模式的土壤全氮含量均顯著高于CK，土壤細菌群落豐富度指數(Chao1和ACE)除T7處理外，其余處理均顯著高于CK；土壤全氮、全鉀、速效氮含量是不同輪作休耕模式土壤細菌群落結構演變的重要因素。