基質(zhì)分散固相萃取-QuEChERS耦合HPLC法測(cè)定棉花葉片中吡蟲(chóng)啉及其相關(guān)代謝物

節(jié)夢(mèng)蕾，時(shí)英爽，高有華，韓 瑤，袁 震，景偉文

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院, 新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 新疆 烏魯木齊 830052)

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，新疆是我國(guó)棉花的主產(chǎn)區(qū)。棉花的種植過(guò)程中每年都要大量使用吡蟲(chóng)啉農(nóng)藥來(lái)防治蟲(chóng)害[1]。吡蟲(chóng)啉(1-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-硝基咪唑-2-亞胺，imidacloprid，IMI)是新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑的第1個(gè)成員。該殺蟲(chóng)劑通過(guò)破壞昆蟲(chóng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的煙堿乙酰膽堿受體起作用，應(yīng)用較為廣泛[2-4]。吡蟲(chóng)啉屬于內(nèi)吸性農(nóng)藥，當(dāng)用于農(nóng)作物時(shí)，殺蟲(chóng)劑到達(dá)植物的內(nèi)部并轉(zhuǎn)化為多種代謝物。吡蟲(chóng)啉降解產(chǎn)生的幾種代謝物中，一些具有生物活性的代謝物在很大程度上被植物保留。這些代謝物因其比農(nóng)藥母體具有更強(qiáng)的生態(tài)毒性和環(huán)境穩(wěn)定性，對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康的危害甚至遠(yuǎn)高于農(nóng)藥母體[5-7]。因此，研究棉花葉片中吡蟲(chóng)啉及其代謝物對(duì)科學(xué)合理使用農(nóng)藥、提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)以及全面評(píng)價(jià)其環(huán)境影響都有著重要的意義。目前大多數(shù)分析研究主要集中在母體化合物上，有關(guān)其代謝物的研究非常有限[8-9]。

吡蟲(chóng)啉在不同介質(zhì)中的代謝途徑主要通過(guò)以下4種方式來(lái)進(jìn)行：(1)經(jīng)反硝化作用直接產(chǎn)生吡蟲(chóng)啉胍，然后進(jìn)一步氧化為吡蟲(chóng)啉脲；(2)吡蟲(chóng)啉中的硝基被還原成為亞硝基衍生物，亞硝基進(jìn)一步被還原成為吡蟲(chóng)啉胍；(3)咪唑環(huán)被氧化形成4,5-二羥基吡蟲(chóng)啉，然后脫水形成烯式吡蟲(chóng)啉；(4)再經(jīng)水解形成6-氯煙酸(6-CNA)，并與介質(zhì)中共存的小分子(氨基酸，麥芽糖，葡萄糖，丁二酸等)形成不同的結(jié)合物 。

建立吡蟲(chóng)啉及其代謝物含量的測(cè)定方法是進(jìn)行相關(guān)研究的前提條件。農(nóng)藥測(cè)定的主要步驟包括樣品預(yù)處理和儀器分析[10-11]。QuEChERS前處理方法由美國(guó)農(nóng)業(yè)部Anastassiadas M等[11]于2003年提出，是當(dāng)前在農(nóng)藥殘留提取上使用最為普遍的前處理技術(shù)之一，得名于其快捷、簡(jiǎn)易、廉價(jià)、有效、可信、安全的特征。由于方法本身具有模板的性質(zhì)，為適應(yīng)不同基質(zhì)和分析物的測(cè)定要求，需不斷進(jìn)行嘗試和改進(jìn)。而與葉類(lèi)蔬菜食品相比，作物葉片中富含大量的酚類(lèi)、酯類(lèi)和色素類(lèi)物質(zhì)，因此基于測(cè)定基質(zhì)的不同特點(diǎn)，要求前處理方法有一定的適應(yīng)性，但目前大量的研究結(jié)果集中在食品方面[12-14]。另外，目前主要采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)對(duì)吡蟲(chóng)啉代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。王建華等[15]利用HPLC-MS/MS技術(shù)建立的分析方法回收率為71.9%～117.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.8%～9.6%，定量限(LOQ)為0.2～1.0 μg·kg-1。Polat等[16]利用LC-MS/MS技術(shù)建立的分析方法回收率為107.12%，RSD為17.96%。Xu等[17]利用UPLC-MS/MS技術(shù)建立的分析方法回收率為60.5%～114.6%，RSD<20%，LOQ為0.1～17.3 μg·kg-1。Seo等[18]利用HPLC-MS技術(shù)建立的分析方法RSD≤20%，回收率為70%～120%，檢出限(LOD)達(dá)到5～10 μg·g-1。雖然上述研究所建立的分析方法完全滿足測(cè)定要求，但是LC-MS技術(shù)儀器投資成本高，操作也比較復(fù)雜，目前還未得到廣泛運(yùn)用。HPLC因具有成本低、靈敏度高、基體效應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)[19]，仍然是運(yùn)用最為廣泛的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法。因此，建立吡蟲(chóng)啉和代謝物同時(shí)測(cè)定的色譜方法，不失為現(xiàn)行條件下經(jīng)濟(jì)、快速、全面檢測(cè)農(nóng)藥殘留的不二選擇。但目前可以借鑒的研究并不多。本研究采用QuEChERS方法耦合HPLC方法測(cè)定棉花葉片中的吡蟲(chóng)啉和代謝物，針對(duì)測(cè)定基質(zhì)的不同特點(diǎn)對(duì)QuEChERS前處理方法中的相關(guān)影響因素逐一進(jìn)行了詳細(xì)討論，并探索出適當(dāng)?shù)腍PLC測(cè)定條件，最后運(yùn)用該方法對(duì)樣品中吡蟲(chóng)啉及其4種代謝物6-氯煙酸、吡蟲(chóng)啉胍、烯式吡蟲(chóng)啉和吡蟲(chóng)啉脲的殘留情況進(jìn)行了定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑以及溶液的配制

儀器和試劑：LC-20AB高效液相色譜儀(島津公司，日本)；吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)品(100 μg·mL-1，純度>97%)購(gòu)自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司。6-氯煙酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司。烯式吡蟲(chóng)啉(純度>98.7%)、吡蟲(chóng)啉脲(純度>99.7%)和吡蟲(chóng)啉胍標(biāo)準(zhǔn)品(純度>83.9%)均購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。QuEChERS方法所用試劑均購(gòu)自深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：以流動(dòng)相溶解后定容，配制成質(zhì)量濃度分別為10.00、510.00、400.00、570.00 mg·L-1和520.00 mg·L-1的吡蟲(chóng)啉、吡蟲(chóng)啉脲、烯式吡蟲(chóng)啉、吡蟲(chóng)啉胍、6-氯煙酸單標(biāo)儲(chǔ)備液。而后分別準(zhǔn)確移取適量上述單標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋成所需濃度。溶液4℃避光保存。

1.2 大田施藥方法和樣品材料準(zhǔn)備

在新疆烏魯木齊三坪農(nóng)場(chǎng)按制劑量47.25 g·hm-2于2018年8月手動(dòng)噴霧葉面施用吡蟲(chóng)啉粉劑(70%水分散粒劑)。另設(shè)清水空白對(duì)照，處理間設(shè)保護(hù)帶。小區(qū)面積為15 m2,各處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，藥后定時(shí)采樣。隨機(jī)采集棉花葉片1 kg帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)貯于低溫冰箱中保存待用。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 樣品的前處理方法 稱(chēng)取10.00 g打碎后的棉花葉片于50 mL離心管中，加入20.00 mL乙腈，振蕩5 min后加入鹽析材料，搖勻，振蕩5 min后超聲3 min，于4 000 r·min-1下離心5 min，取2.00 mL上清液快速加入帶有凈化劑的離心管中，快速手動(dòng)振搖后將上清液以0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.3.2 色譜檢測(cè)條件 取20 μL濾液HPLC進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積。儀器：SPD-20紫外檢測(cè)器；色譜柱：ODS-3(4.6 mm×250 mm, i.d., 5 μm)，測(cè)定波長(zhǎng)：270 nm；洗脫方式：等度洗脫；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.3 方法的驗(yàn)證和應(yīng)用 每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果取其平均值，方法驗(yàn)證和樣品測(cè)定具體見(jiàn)文章2.5和2.6小節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

HPLC中流動(dòng)相種類(lèi)會(huì)直接影響目標(biāo)物檢測(cè)的選擇性、靈敏度和分離效果[20]。由于代謝物在結(jié)構(gòu)和極性上相似性較高，因此給分離測(cè)定帶來(lái)一定困難。考察不同流動(dòng)相的分離結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用2%乙腈/甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，能夠得到較好的峰形和較高的分離度且雜質(zhì)干擾較少，檢測(cè)效果較好。因此，確定流動(dòng)相為2%乙腈/甲醇-水，比例3∶7，流速0.7 mL·min-1(參看圖4)。

2.2 提取溶劑的選擇

提取劑的選擇對(duì)試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果有著直接影響。乙腈是適宜范圍較寬的常用萃取劑，并且對(duì)于含色素較多的樣品也顯示出理想的提取效果[21]。考慮到提取溶劑pH值對(duì)棉花葉片中農(nóng)藥回收率的影響，本文采用乙腈和5%甲酸-乙腈進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，按上述的分析方法和液相色譜條件對(duì)樣品進(jìn)行分析測(cè)定。如圖1所示，當(dāng)以乙腈作為提取劑時(shí)，所得的吡蟲(chóng)啉及其4種代謝物的回收率較高，并且其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，提取效果良好。本實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈作為提取溶劑。

圖1 乙腈和5%甲酸-乙腈的提取效果比較

2.3 鹽析材料的選擇

QuEChERS前處理方法的鹽析材料有兩種，第一種是EN方法推薦的無(wú)水MgSO4、Na3C6H5O7和C6H6Na2O7，另一種是AOAC方法推薦的無(wú)水MgSO4和無(wú)水C2H3NaO2[22-23]。在樣品提取液中分別添加這兩種萃取鹽析材料(鹽析試劑A：6.00 g MgSO4，1.00 g NaCl，1.50 g C2H3NaO2；B：4.00 g MgSO4，1.00 g NaCl，1.00 g Na3C6H5O7，0.50 g C6H6Na2O7)，結(jié)合使用凈化材料進(jìn)行前處理，其他步驟同1.3.1，以回收率考察萃取效果。所得鹽析試劑A組合對(duì)吡蟲(chóng)啉及其代謝物的回收率為5.00%～108.44%，RSD為0.03%～15.33%。鹽析試劑B組合的回收率為54.50%～108.30%，RSD為0.07%～2.08%，其結(jié)果偏差小，更穩(wěn)定，效果好于A。故1.00 g氯化鈉、4.00 g無(wú)水硫酸鎂、0.50 g檸檬酸二鈉鹽和1.00 g檸檬酸鈉為選用的鹽析材料。

2.4 凈化劑的選擇及用量

PSA(N-丙基乙二胺)、C18和GCB(石墨化碳黑)為QuEChERS前處理方法中常用的固相萃取吸附劑。在離心管中依次將C18、PSA、C18+PSA、C18+PSA+GCB這4種組合的凈化材料分散加入到樣品的萃取液中吸附干擾物，其他前處理步驟不變，同樣以回收率檢驗(yàn)凈化效果，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，綜合所有代謝物的回收率來(lái)看，PSA能有效地吸附雜質(zhì)而不影響目標(biāo)物的測(cè)定。同時(shí)結(jié)合圖4發(fā)現(xiàn)，PSA能夠消除吡蟲(chóng)啉及其代謝物目標(biāo)峰周?chē)蓴_雜質(zhì)的影響。因此，PSA作為本次試驗(yàn)的凈化材料最為適宜。

圖2 凈化劑的種類(lèi)對(duì)回收率的影響(用量均為50 mg)

吸附劑用量也會(huì)對(duì)雜質(zhì)凈化產(chǎn)生影響，用量過(guò)少，基質(zhì)去除不完全；用量過(guò)多，則分散劑會(huì)吸附分析物，影響到回收率，因此需對(duì)PSA的使用量進(jìn)行篩選。分別取10、20、25、30、40、50 mg PSA于離心管中，各加入棉花葉片樣品提取液，其余預(yù)處理步驟不變，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)PSA的用量為25 mg時(shí)，能得到較好的回收率，效果最佳，因此將25 mg選為適宜用量。

圖3 PSA的用量對(duì)回收率的影響

2.5 方法學(xué)的驗(yàn)證

取10.00 g空白棉花葉片樣品，加入不同濃度吡蟲(chóng)啉的混標(biāo)溶液，采用乙腈作為提取液，試劑A組合作為鹽析材料，25 mg PSA作為凈化劑，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。我國(guó)NY/T 788—2004《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[24]對(duì)于檢測(cè)分析方法的要求是：當(dāng)添加濃度大于0.01 mg·kg-1時(shí)，其合適的回收率應(yīng)在70.00%～120.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)小于10.00%。由表1可知，在不同添加水平下，6-氯煙酸、吡蟲(chóng)啉胍、烯式吡蟲(chóng)啉、吡蟲(chóng)啉脲和吡蟲(chóng)啉的回收率分別為96.47%～109.32%、96.80%～110.90%、92.84%～107.61%、93.86%～105.98%和98.15%～107.73%，RSD分別為0.15%～1.17%、0.72%～1.31%、3.75%～6.99%、0.79%～5.03%和3.21%～5.92%。各指標(biāo)的具體測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。6-氯煙酸、吡蟲(chóng)啉胍、烯式吡蟲(chóng)啉、吡蟲(chóng)啉脲和吡蟲(chóng)啉的LOD分別為0.0066、0.091、0.0011、0.042 mg·kg-1和0.0044 mg·kg-1，LOQ分別為0.028、0.036、0.0059、0.19 mg·kg-1和0.015 mg·kg-1，相關(guān)系數(shù)在0.9988～0.9998之間。由此表明，該方法能夠滿足定量分析的基本要求。

表1 樣品的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

表2 吡蟲(chóng)啉及其代謝物的檢出限、定量限、線性范圍和線性方程

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

以上述建立的方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定(詳例如圖4)。測(cè)定結(jié)果顯示，噴藥后0～7 d，代謝物在棉花葉片中均未檢出，吡蟲(chóng)啉的含量為0.53～1.99 mg·kg-1。第10天檢出6-氯煙酸，10～15 d的吡蟲(chóng)啉及代謝物6-氯煙酸、吡蟲(chóng)啉胍、烯式吡蟲(chóng)啉、吡蟲(chóng)啉脲的含量分別為0.20～0.23、0.79～2.16、0.09、0.06 mg·kg-1和0.28 mg·kg-1，此時(shí)吡蟲(chóng)啉已不是主要的殘留物。

注：Ⅰ～Ⅴ依次代表6-氯煙酸，吡蟲(chóng)啉胍，烯式吡蟲(chóng)啉，吡蟲(chóng)啉脲，吡蟲(chóng)啉。Note:Ⅰ～Ⅴ: mean 6-chloronicotinic acid, guanidine-imidacloprid, olefin imidacloprid, imidacloprid urea, imidacloprid, respectively.

3 討 論

QuEChERS前處理方法采用凈化劑的目的是盡量使吡蟲(chóng)啉與樣品基質(zhì)分離，從而減少樣品中其他組分對(duì)目標(biāo)物的干擾，采用不同凈化材料的效果不同。GCB可有效去除基質(zhì)中色素[25]，也對(duì)某些農(nóng)藥有一定吸附作用[26]，使用GCB作為凈化吸附劑時(shí)，吡蟲(chóng)啉脲被GCB吸附，導(dǎo)致回收率小于20%。N-丙基乙二胺(PSA)屬于固相吸附劑，能夠與金屬離子反應(yīng)形成鰲合物以及與羥基形成共價(jià)鍵氫鍵，主要用于去除糖類(lèi)、酚類(lèi)、有機(jī)酸，尤其對(duì)于有機(jī)酸和極性化合物的親和性比較好，同時(shí)對(duì)大部分農(nóng)藥吸附能力較弱，因而作為固相萃取物被廣泛地用作農(nóng)藥殘留檢測(cè)的凈化劑。棉花葉片基質(zhì)中的主要干擾物為有機(jī)酸、多酚、碳水化合物和甾醇等，PSA作為弱陰離子交換吸附劑，通過(guò)對(duì)上述干擾物進(jìn)行吸附能夠達(dá)到較好的凈化效果，但PSA對(duì)目標(biāo)物也有一定的吸附作用。確定合適的PSA用量不但能提高吡蟲(chóng)啉及其4種代謝物的凈化效果，同時(shí)能減少凈化劑對(duì)棉花葉片樣品中檢測(cè)目標(biāo)物的損耗，保證回收率。在提取液中加入C18吸附劑能夠吸附去除棉花葉片中較少的脂肪類(lèi)物質(zhì)，進(jìn)一步提高對(duì)吡蟲(chóng)啉的凈化效果。但是C18對(duì)代謝物烯式吡蟲(chóng)啉和吡蟲(chóng)啉脲有吸附作用，使得其回收率降低。綜合考慮，本試驗(yàn)使用PSA為凈化劑，結(jié)合適當(dāng)?shù)纳V分離條件，得到了滿意的結(jié)果。

根據(jù)2002年農(nóng)藥殘留聯(lián)合專(zhuān)家會(huì)議(JMPR)報(bào)告，以14C標(biāo)記的吡蟲(chóng)啉對(duì)其代謝進(jìn)行研究，以番茄為例，在溫室栽培條件下，對(duì)未成熟果實(shí)在收獲前14 d進(jìn)行葉面噴施8 mL 0.2%的25%吡蟲(chóng)啉可濕性粉劑(WP)溶液，用水量600 L·hm-2。測(cè)定結(jié)果為：放射性殘留總量(total radioactive residues,TRR)呈減少趨勢(shì)，從噴施后4 d的1.01 mg·kg-1到7 d和14 d后的0.84、0.85 mg·kg-1以至收后21 d的0.64 mg·kg-1；噴施后21 d，測(cè)得5-羥基吡蟲(chóng)啉(0.027 mg·kg-1)占4.2%，烯式吡蟲(chóng)啉(0.007 mg·kg-1)占1.1%。白雪松[27]研究了吡蟲(chóng)啉及6-氯煙酸在玉米中殘留和消解動(dòng)態(tài)，結(jié)果表明：吡蟲(chóng)啉及其代謝產(chǎn)物6-氯煙酸在玉米植株中消解速率快，2 h后檢出6-氯煙酸，0～14 d吡蟲(chóng)啉及6-氯煙酸的含量分別為1.23～0.46、0.04～0.40 mg·kg-1。Akoijam等[28]測(cè)定大米中的吡蟲(chóng)啉和代謝產(chǎn)物的含量，其中吡蟲(chóng)啉和代謝物(6-氯煙酸、烯式吡蟲(chóng)啉和吡蟲(chóng)啉脲)的總殘留量為4.57 mg·kg-1和13.94 mg·kg-1。Sharma等[29]研究吡蟲(chóng)啉和6-氯煙酸在甘蔗葉片中的含量，發(fā)現(xiàn)施藥7 d后，其在甘蔗葉片中的含量分別為4.97 mg·kg-1和12.99 mg·kg-1。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，利用本文的分析方法所測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果類(lèi)似但又有所不同，表明吡蟲(chóng)啉及其代謝物在不同基質(zhì)上檢出的時(shí)間和所占比例存在明顯的差異[30-31]，故而需要在建立分析方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行具體場(chǎng)景條件下的測(cè)定和研究。

4 結(jié) 論

本研究建立了以QuEChERS前處理為基礎(chǔ)的棉花葉片中吡蟲(chóng)啉及其4種代謝物——吡蟲(chóng)啉脲、烯式吡蟲(chóng)啉、吡蟲(chóng)啉胍和6-氯煙酸的高效液相色譜(HPLC)分析方法。以QuEChERS前處理方法為基礎(chǔ)，考察了方法的提取溶劑、鹽析材料和凈化劑種類(lèi)及用量的影響。以有效去除基質(zhì)中雜質(zhì)干擾為前提，采用HPLC對(duì)樣品進(jìn)行定量分析，驗(yàn)證了方法的性能參數(shù)，結(jié)果表明本方法是一種簡(jiǎn)單、快捷、可靠的檢測(cè)方法。