響鈴草薄層鑒別研究

石洋　王慧娟　彭禮軍　郝永佳　張敏

【摘 要】 目的：建立響鈴草的薄層色譜鑒別方法。方法：采用硅膠GF254薄層板，黃酮類物質(zhì)芹菜素、金合歡素、染料木素和山柰素為對照品，環(huán)己烷-乙酸乙酯-水（8∶5∶1）為展開劑，對響鈴草藥材進行薄層色譜定性鑒別。結果：薄層色譜圖中可見與染料木素、金合歡素以及山柰素在其相對應位置顯相同顏色斑點，且斑點清晰，方法耐用性好。結論：該方法安全、易操作、專屬性強，可作為響鈴草的薄層鑒別方法。

【關鍵詞】 響鈴草;薄層鑒別;質(zhì)量標準

【中圖分類號】R285 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2020）23-0047-04

TLC Identification of Crotalaria ferruginea

SHI Yang1 WANG Huijuan2 PENG Lijun2 HAO Yongjia1 ZHANG Min2*

1.Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025，China;2.Guizhou Medicine Edicine Edible Plant Resources Research and Developmant Center， Guizhou University， Guiyang 550025， China

Abstract：Objective To establish TLC identification method of Crotalaria ferruginea. Methods Using flavonoid apigenin， acacetin， genistein and kaempferol as reference substances， Crotalaria ferruginea were identified by TLC on silica gel GF254 plate with developing solvent hexamethylene- ethyl acetate- water （8∶5∶1）.Results Based on the position and color of reference substances， it showedthe corresponding spots of Crotalaria ferruginea in TLC. The spots are clear and the method has good durability.Conclusion The developed method is safe， easy to operate and strong in specificity， and can be used TLC identification method of Crotalaria ferruginea.

Keywords：Crotalaria ferruginea; TLC; Quality Standards

響鈴草是云南白族常用的民間藥材，為豆科豬屎豆屬條葉豬屎豆C. linifolia L. f. 或假地藍Crotalaria ferruginea Grah.的根或全草，又名馬鈴草、狗響鈴、響鈴子、黃花野百合等[1]。響鈴草史載于明代《滇南本草》，其味苦、微酸，性寒，具有補脾腎、斂肺氣、利水、解毒之功效。主要用于久咳痰血、耳鳴耳聾、頭暈目眩、夢遺、慢性腎炎、膀胱炎、腎結石、扁桃體炎、淋巴腺炎、惡瘡、月經(jīng)不調(diào)等[2]。

響鈴草的主要化學成分為黃酮、生物堿、香豆素、有機酸和甾醇等，其中黃酮類物質(zhì)芹菜素、金合歡素、染料木素和山柰素通常作為評價該藥材質(zhì)量的重要指標[3-5]。目前，從響鈴草質(zhì)量標準中關于黃酮類物質(zhì)薄層色譜鑒別的研究中發(fā)現(xiàn)僅存在對染料木素的鑒別，尚未見對于其他黃酮類成分的薄層鑒別報道。因此，本文以云南省景谷縣威遠鎮(zhèn)產(chǎn)響鈴草為研究對象，對其進行薄層鑒別方法研究，建立響鈴草的薄層鑒別方法，為響鈴草的質(zhì)量標準建立提供支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DK-98型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）;HZY-A200型電子分析天平（福州華志科學儀器有限公司）;RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;QY-20三用紫外分析儀（上海奧瑞德精密儀器有限公司）;DGG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）;FW-400A傾斜式高速萬能粉碎機（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.2 試藥 對照品芹菜素（Q-002-180131）、金合歡素（J-066-180517）、染料木素（R-001-181216）和山柰素（S-004-180911），均購于成都瑞芬思生物科技有限公司;9批響鈴草藥材樣品購于藥材市場，分別產(chǎn)于四川、青川、四川成都、云南省景谷縣威遠鎮(zhèn)、廣西、貴州省安順、福建、云南、貴州，經(jīng)貴陽中醫(yī)藥大學魏升華教授鑒定為豆科植物假地藍Crotalaria ferruginea Grah.的根或全草。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備 參照文獻總黃酮的提取方法[6]： 稱取樣品粉末用95%乙醇1∶10倍量水浴回流提取2h，過濾;再用95%乙醇1∶6倍量水浴回流提取2次，每次1.5h;合并3次濾液，水浴減壓回收至無醇味，稠膏趁熱用5%碳酸鈉溶液溶解，過濾;再用濃鹽酸調(diào)pH=2～3，過濾，將沉淀干燥即得黃酮粗品。考慮到提取時間較長，故將提取時間減為2h，其余條件不變，與提取時間為5h對比，發(fā)現(xiàn)不同的提取時間對供試液展開效果影響不大，考慮到節(jié)省時間，故將提取時間定為2h。另外，還考察了不同堿性處理和酸性條件對供試液的影響，結果發(fā)現(xiàn)原條件5%的碳酸鈉溶液和pH=2～3處理的供試液展開效果最優(yōu)。

響鈴草供試品溶液的制備方法：稱取樣品粉末2g，加乙醇20mL，回流提取2h，過濾，減壓蒸至無醇味，稠膏趁熱用5%碳酸鈉溶液溶解，過濾，再用濃鹽酸調(diào)pH=2～3，靜置沉淀;然后用乙酸乙酯萃取兩次，最后用0.5mL乙酸乙酯溶解得供試品溶液。

2.2 薄層色譜展開條件考察 按2.1下供試品溶液的制備方法制備響鈴草供試品溶液，取適量供試品溶液點于硅膠GF254薄層板上，分別在下展開系統(tǒng)中展開：①乙酸乙酯-三氯甲烷-水（4∶9∶1）;②環(huán)己烷-乙酸乙酯-水（5∶4∶1）;③乙酸乙酯-氯仿-環(huán)己烷-水（4∶3∶2∶1），展開后，取出晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視。結果見圖1，在展開系統(tǒng)②環(huán)己烷∶乙酸乙酯∶水=5∶4∶1條件下，色譜圖斑點清晰，分離效果最好。在此基礎上，將各組成分間的比例進行微調(diào)，考察不同的展開劑比例對分離效果的影響（圖2～4），最終確定了響鈴草供試品TLC展開劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯-水（8∶5∶1）。

2.3 薄層色譜鑒別 按2.1下供試品溶液的制備方法制備響鈴草供試品溶，取適量供試品溶液與對照品溶液山柰素（0.5mg/mL）、金合歡素（0.5mg/mL）、染料木素（0.25mg/mL）和芹菜素（0.5mg/mL）點于硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷∶乙酸乙酯∶水=8∶5∶1為展開劑，展開后，取出晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視。結果如圖7所示，響鈴草中黃酮類成分在紫外光254nm下與山柰萘素、金合歡素和染料木素在相對應的位置顯相同顏色斑點。

2.4 方法耐用性考察

2.4.1 重復性考察 分別稱取三份響鈴草粉末，按2. 1下方法制備成三份平行供試液。將三份供試液點于同一薄層層析板上，以環(huán)己烷∶乙酸乙酯∶水=8∶5∶1為展開劑，展開后，取出晾干，置紫外燈（254nm）下檢視，結果顯示重復性較好。

2.4.2 不同薄層板分離效果考察 取供試品和對照品溶液分別點于青島海洋化工廠、煙臺市芝罘黃務硅膠開發(fā)試驗廠以及自制的硅膠薄層板上。除自制硅膠板分離效果稍差外，商品化的預制板均具有良好的分離效果。

2.4.3 不同溫度對分離效果影響的考察 將供試品和對照品溶液點于硅膠薄層板上，分別在4 ℃、室溫（28 ℃）以及37 ℃的環(huán)境下展開。結果表明在上述條件下都能較好分離，斑點清晰，未有明顯差異。

2.4.4 不同濕度對分離效果影響的考察 將供試品和對照品溶液點于硅膠薄層板上，在室溫下，相對濕度分別為18%、32%、58%、72%、88%下展開。結果顯示，在18%～88%相對濕度條件下分離結果相似，不同濕度對響鈴草的薄層鑒別沒有影響。

2.5 不同批次響鈴草薄層色譜 將產(chǎn)地分別為貴州、云南景谷縣威遠鎮(zhèn)、四川、四川成都、廣西、貴州安順、福建、云南以及青川共九個不同批次的響鈴草藥材制備成相對應的的供試品溶液，將其與對照品溶液點于同一薄層板上，以環(huán)己烷∶乙酸乙酯∶水=8∶5∶1為展開劑，展開后，取出晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視，結果如圖6所示。

9批響鈴草藥材中以云南景谷縣威遠鎮(zhèn)所產(chǎn)響鈴草的展開斑點較為清晰明顯，故而將其作為對照藥材。不同產(chǎn)地的響鈴草中各黃酮類成分稍有不同，含量也有一定差異，但9批響鈴草的薄層色譜圖中除了來自福建的斑點很不清晰外，均可見與染料木素、金合歡素以及山柰素在其相對應位置顯相同斑點。部分批次供試品與芹菜素在相同位置顯相同顏色斑點。

3 討論

黃酮類化合物是響鈴草的主要活性成分之一，其中金合歡素、染料木素和山柰素等具有多種藥理作用，通常是評價該藥材質(zhì)量的重要指標。本實驗研究了響鈴草中黃酮類成分薄層色譜鑒別，主要包括對供試品溶液的制備方法以及TLC展開條件的考察，為響鈴草藥材建立安全、易操作、專屬性強的薄層色譜鑒別方法。同時，本實驗從響鈴草藥材中同時鑒別出染料木素、金合歡素以及山奈素，進一步為評價響鈴草的質(zhì)量和響鈴草資源的開發(fā)利用提供參考，也為完善響鈴草藥材薄層鑒別方法以及全面評價響鈴草藥材提供實驗資料和科學依據(jù)。

參考文獻

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[2]聞焜，欣桃.響鈴草的研究進展[J].中國民族民間醫(yī)藥，2016，25（17）：51 - 54.

[3]張旭，龍飛，鄧贊，等.響鈴草化學成分研究[J].中草藥，2008，39（2）：176-178.

[4]劉筱琴，邵鑒魏，王伯初，等.響鈴草藥材質(zhì)量控制研究[J]. 西南師范大學學報（自然科學版），2011，36（4）：160.

[5]唐倩，楊憲，劉應杰，等. 響鈴草藥材中總黃酮和3種黃酮苷元的測定方法及含量變化研究[J]. 林產(chǎn)化學與工業(yè)，2010，30（4）：93 – 98.

[6]李成義，李波，王明偉，等.甘肅地產(chǎn)紅芪中總黃酮的提取與鑒別[J]. 甘肅中醫(yī)，2009， 22（3）：61 - 62.

（收稿日期：2020-06-10 編輯：劉斌）

基金項目：貴州省中藥民族藥材質(zhì)量標準研究（DB52/YC231-2013）。

作者簡介：石洋（1989-），女，漢族，博士，講師，研究方向為藥物分析。E-mail： xiaoyewater@163.com

通信作者：張敏（1988-），女，漢族，碩士，中級實驗師，研究方向為儀器分析與藥物分析。E-mail： minzhang@163.com