NaCl和NaHCO3混合鹽脅迫對馬藺幼苗生理特性的影響

袁澤斌，牟昌紅，王波，孫向麗,2,3*

(1.蘇州大學 建筑學院風景園林系，江蘇 蘇州 215123； 2.蘇州市建筑與城市環境重點實驗室，江蘇 蘇州 215123；3.蘇州大學 蘇州園科集團建筑與城市環境協同創新中心，江蘇 蘇州 215123)

鹽堿土在我國分布廣泛，嚴重制約著農業生產。我國耕地鹽堿化面積超過760萬hm2，占總耕地面積的1/5，主要分布在東北、華北及西北內陸地區[1]。鹽堿土中的離子會抑制植物對養分的吸收[2]，還會提高土壤中重金屬的遷移能力[3]。采用植物改良的方式雖周期較長，卻能從根本上改善土壤理化性質，同時還能產生經濟效益，被認為是最經濟持久的方法[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物馬藺的種子由江蘇省沭陽斗研種業有限公司提供。選取籽實飽滿，種皮完好的馬藺種子，在50 ℃以下的溫水中浸種3 d，期間每天更換水2～3次，最后1次換水時把生根粉倒進去一起浸泡10 min，撈出晾干，然后播種在盛有石英砂和泥炭的基質中，覆蓋薄膜，每3 d澆1次水，保持基質處于濕潤狀態，待幼苗長至10 cm時，移栽至直徑10 cm的小花盆中，并用鹽溶液處理，每個小花盆中盛100 g基質。

1.2 方法

1.2.1 幼苗的處理方法

試驗于2019年3—4月在蘇州大學建筑學院栽培生理實驗室進行。將栽有馬藺幼苗的小花盆放置在規格相同的白色托盤中，每個托盤中放置相同數量的馬藺幼苗，以清水處理為空白對照，其余5個處理分別為0.30% NaCl、0.20% NaCl+0.10% NaHCO3、0.15% NaCl+0.15% NaHCO3、0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3五種鹽溶液組合(所有濃度均為質量分數)，分別將配制好的鹽溶液以每盆100 mL倒入托盤中，讓馬藺幼苗充分吸收鹽溶液，直至完全吸收。試驗過程中，每7 d取1次樣，并給幼苗澆1次水，每處理幼苗80棵，為減小試驗誤差，每次取樣時隨機選取15棵剪取幼苗葉片，每5棵為1個重復，每處理3個重復，共取樣5次，每次取樣完后剪取了葉片的幼苗棄用。

1.2.2 生理特性指標測定

SPAD值的測定采用SPAD-502葉綠素儀，Pro含量測定采用磺基水楊酸比色法，可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法，SOD、POD、CAT酶活性的測定采用蘇州科銘生物技術有限公司生產的試劑盒進行測定。

1.3 數據處理

采用Excel 2010軟件進行數據的整理與圖表的繪制，SPSS 22.0進行數據的統計分析，運用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 混合鹽脅迫對馬藺幼苗葉片SPAD值的影響

SPAD值(綠色度)與葉子的葉綠素含量呈顯著正相關，可對葉片中的葉綠素水平提供可靠估計[9]。表1顯示，通過對鹽脅迫后的馬藺幼苗葉片的SPAD值的測定表明，在脅迫第7天時，各處理的幼苗葉片葉綠素含量未出現顯著差異。隨著脅迫時間的延長，對照處理的幼苗葉片葉綠素含量呈顯著遞增趨勢，而其他處理均為先增長后降低。在脅迫第21天時，除對照外，其余各處理的幼苗葉片葉綠素含量達到最大，而后呈下降趨勢。在脅迫第35天時，各處理葉綠素含量與對照相比均顯著降低，其中含量最低的為0.10% NaCl+0.20% NaHCO3處理的幼苗葉片，僅為28.90，較對照降低29.73%；其次為0.30%NaHCO3處理的幼苗葉片，為29.50，較對照降低28.28%；混合鹽中NaHCO3濃度越大，幼苗葉片中的葉綠素含量越低。

表1 不同鹽分組合對馬藺幼苗葉片SPAD值的影響

注：同列數據后無相同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。表2～3同。

2.2 混合鹽脅迫對馬藺幼苗Pro含量的影響

Pro積累與脅迫耐受性有關[10-11]。Pro被認為是一種滲透調節劑，可保護細胞免受應激造成的損傷[12-13]。通過對鹽脅迫后不同時間馬藺幼苗葉片中Pro含量的測定(表2)表明，空白對照組的馬藺幼苗葉片中的Pro含量變化較穩定，其余各處理隨著脅迫時間的延長均呈先增長后下降的趨勢。在處理的第7天，經0.3% NaHCO3溶液處理的幼苗葉片中Pro含量較其他處理已顯著上升，達到5.04 μg·g-1；第21天時含量達到最大，為7.34 μg·g-1，為空白對照的1.70倍；在第35天時，經0.30% NaCl和0.20% NaCl+0.10% NaHCO3處理的幼苗葉片中的Pro含量較對照顯著下降，0.15% NaCl+0.15% NaHCO3、0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理中Pro含量仍顯著高于對照組。

表2 不同鹽分組合對馬藺幼苗葉片Pro含量的影響

2.3 混合鹽脅迫對馬藺幼苗可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是一種重要的滲透調節物質和營養物質，其增加和積累能夠提高植物細胞的保水能力，對細胞的生命物質及生物膜起到保護作用，也是篩選抗逆性的指標之一[14]。通過對鹽溶液脅迫后不同時間馬藺幼苗葉片中可溶性蛋白含量的測定(表3)表明，隨著脅迫時間的延長，CK處理的可溶性蛋白含量較穩定，0.30% NaCl、0.20% NaCl+0.10% NaHCO3、0.15% NaCl+0.15% NaHCO3處理幼苗葉片中的可溶性蛋白含量表現出“下降、上升”的趨勢，而0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理則表現為“下降、上升、下降”的趨勢。在脅迫的第7天，可溶性蛋白含量最低的為0.30% NaHCO3處理，僅為0.238 mg·g-1，較0.30% NaCl、0.20% NaCl+0.10% NaHCO3處理顯著下降；第21天時，0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理的可溶性蛋白含量較其他處理顯著升高，分別達到0.273和0.285 mg·g-1；第35天時，可溶性蛋白含量最高的為0.30% NaCl處理的幼苗葉片，而0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理較其他處理顯著降低，推測原因可能是這兩個處理對幼苗的脅迫作用較強，導致可溶性蛋白逐漸降解。

表3 不同鹽分組合對馬藺幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響

2.4 混合鹽脅迫對馬藺幼苗抗氧化酶系統的影響

2.4.1 SOD酶活性

植物的抗氧化酶系統包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽還原酶(GR)等多種酶類，是植物在遭受逆境脅迫時重要的防御體系[15]。各酶活性之間的平衡可將超氧自由基和H2O2維持在穩定水平[16]。SOD是抗氧化酶系統中的第一道防線[17]，其作用是保護細胞免受超氧化物誘導的氧化脅迫[18]。通過對鹽脅迫后不同時間馬藺幼苗葉片中SOD活性的測定(圖1)表明，經各鹽脅迫處理的幼苗葉片中的SOD的活性均始終高于空白對照組，0.30% NaCl、0.20% NaCl+0.10% NaHCO3、0.15% NaCl+0.15% NaHCO3處理隨著脅迫時間的延長總體上呈現出不斷上升的趨勢。在第35天時，SOD活性分別為第7天的1.72、1.56、1.70倍；在第28天時，0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理的SOD活性達到最大，其中0.30% NaHCO3處理的活性達到1 455.25 U·g-1，為對照的1.73倍；到第35天出現略微下降，說明在鹽脅迫的過程中，馬藺幼苗可通過提高SOD的活性來保護細胞免受超氧化物的影響。

圖1 不同鹽分組合對馬藺幼苗葉片SOD酶活性的影響

2.4.2 CAT酶活性

CAT廣泛存在于植物中，是一種包含血紅素的4聚體酶，在遭受逆境脅迫時，CAT主要負責清除光呼吸和脂肪酸β氧化過程產生的H2O2[19]。通過對鹽脅迫后的馬藺幼苗葉片中CAT活性的測定(圖2)表明，除空白對照組外，各處理幼苗葉片中的CAT酶活性都呈現出“上升、下降”的趨勢。其中，0.30%NaCl、0.20%NaCl+0.10%NaHCO3、0.15%NaCl+0.15%NaHCO3處理的CAT酶活性在脅迫第21天時達到最大，CAT活性最低的為0.20% NaCl+0.10% NaHCO3處理，0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理的CAT活性在脅迫第28天時達到最大，其中0.30% NaHCO3處理的酶活性達到380.97 U·g-1，為對照的1.31倍；在第35天時，各處理的CAT酶活性均較對照小，可能原因是在脅迫初始階段，幼苗體內產生過多的H2O2，CAT活性不斷升高以清除H2O2來維持內環境的穩定，隨著脅迫時間的延長，H2O2不斷積累，毒害植物細胞，致使CAT活性出現急劇下降。

圖2 不同鹽分組合對馬藺幼苗葉片CAT活性的影響

2.4.3 POD酶活性

POD可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用[20]。通過對鹽脅迫后不同時間馬藺幼苗葉片中POD活性的測定(圖3)表明，在脅迫初期，各處理幼苗葉片中的POD活性均呈現出略微下降的趨勢；在第21天時，0.30% NaCl、0.20% NaCl+0.10% NaHCO3、0.15% NaCl+0.15% NaHCO3處理的POD活性急劇升高，最高的為0.30% NaCl處理，達到3 666.67 U·g-1，為空白對照組的2.00倍，而0.10% NaCl+0.20% NaHCO3、0.30% NaHCO3處理在第28天時酶活性達到最大，分別為空白對照組的1.73和1.88倍；在第35天時，除0.10% NaCl+0.20% NaHCO3處理的POD活性較對照略高外，其余處理已降至低于空白對照的水平，原因可能為在初始階段，由于CAT活性的升高及在清除H2O2的過程中起到主導作用，隨著H2O2的不斷積累，CAT的作用有限，POD活性開始升高，與CAT共同作用以清除細胞中的H2O2等有毒有害物質，最終由于鹽脅迫作用的持續，導致POD活性也出現下降趨勢。

圖3 不同鹽分組合對馬藺幼苗葉片POD活性的影響

3 討論

植物耐鹽的生理機制包括逃避鹽害和忍受鹽害兩種方式，滲透調節以及在抗氧化酶系統下參與的膜系統的保護，都屬于忍受鹽害的方式[21]。在鹽堿脅迫下，植物可以通過合成Pro、可溶性蛋白、醇類等有機調節物質來維持細胞內的滲透平衡，這些物質還能起到穩定細胞質中酶分子活性構象的作用[22-23]。研究發現，燕麥[24]、小麥[25]、玉米[26]等農作物在遭受鹽脅迫時可積累Pro和可溶性蛋白來維持正常的生命活動。本研究也發現，在鹽脅迫過程中，Pro和可溶性蛋白含量會有所提高，但隨著脅迫時間的延長，Pro含量在脅迫后期有所下降，這與張明軒等[27-28]在研究NaCl對馬藺幼苗生長的影響時所得出的結論相同。SPAD值可反映葉片中葉綠素的含量。本研究發現，在脅迫時間內，葉片中的葉綠素含量呈先升后降的趨勢，這與劉文瑜等[29-30]在藜麥、樸樹和速生榆上的研究結果一致。植物耐鹽的生理機制是不同作用之間相互協作的，抗氧化酶的保護作用可與滲透調節同時存在。本研究中，馬藺幼苗在鹽脅迫作用下SOD活性會不斷升高，CAT活性會隨著SOD作用不斷產生H2O2而升高，POD的活性則會在CAT清除H2O2能力不足時升高。馬晶晶[21]在研究NaCl鹽脅迫對馬藺幼苗生長的影響時發現，SOD的活性是先降后升的，原因可能是，其處理幼苗所用NaCl濃度為1.5%，為本研究的5倍，在高鹽脅迫下所表現出的酶活性變化和低鹽脅迫下有所差異。

本研究通過用單鹽和混合鹽對馬藺幼苗進行脅迫發現，單鹽的脅迫作用總體上較混合鹽的脅迫作用強，且堿性鹽的脅迫作用較中性鹽脅迫作用強。白文波等[31]在研究NaCl和NaHCO3脅迫下馬藺生長與光合特性時發現，堿性鹽特有的高pH會導致植物體內的生理代謝紊亂，也證明堿性鹽脅迫強于中性鹽。劉丹等[32]發現，單鹽對狗棗獼猴桃幼苗的脅迫作用強于混合鹽，這與本研究結論一致，但其研究結果卻認為，NaCl脅迫作用強于NaHCO3，原因可能為狗棗獼猴桃為大型藤本植物，對NaCl和NaHCO3的響應機制不同。

本研究對馬藺幼苗的耐鹽機制做了生理上的初步探究，馬藺耐鹽基因值得深入研究。本研究采用的為基質培養幼苗，澆灌鹽溶液的方式模擬鹽堿土，與真正的鹽堿土環境存在著一定的差別，所以在今后的研究中也要注重在實際中的應用，為馬藺在鹽堿土改良方面的推廣提供可靠的依據。

綜上所述，通過本研究得出，在脅迫35 d中，各鹽溶液處理后的馬藺幼苗葉片的SPAD值和Pro含量均呈現出先上升后下降的趨勢，其中經0.10% NaCl+0.20% NaHCO3和0.30%NaHCO3溶液處理的幼苗葉片的SPAD值在第35天時下降最顯著；在第21天時，Pro的含量在5個處理中也最多，這兩個處理的幼苗葉片中的可溶性蛋白的變化趨勢與其他處理也不完全相同，表現為“下降、上升、下降”的趨勢，而其余處理則為“下降、上升”；5個處理對抗氧化酶系統中的各種酶活性的影響也存在較大的差別，在脅迫期內，SOD活性總體呈上升趨勢，僅0.10% NaCl+0.20% NaHCO3和0.30%NaHCO3處理的幼苗葉片中SOD活性在第35天時出現略微下降，CAT和POD活性的變化趨勢則大體相同。由此可得，在單鹽中，堿性鹽的脅迫作用較中性鹽的脅迫作用強；混合鹽溶液中，堿性鹽的濃度越大，脅迫就越嚴重，除0.10% NaCl+0.20% NaHCO3鹽溶液組合外，單鹽的脅迫作用較另外兩個鹽溶液組合強。