微型生物養護劑制備及其在水產養殖中的應用

孫承文，賴迎迢，鞏華，劉春花，曹少衛，梁慧麗，陶家發

(中國水產科學研究院 珠江水產研究所，廣東 廣州 510380)

水產養殖中，水體的不穩定性是病害暴發的原因之一。水產養殖中，病害的發生與區域水土、氣候、養殖習慣等密切相關。在養殖區域水體中，加入微型生物養護劑，可優化區域養殖水體中微生物、原生動物、藻類等微型生物多樣性，維護養殖水體環境動態穩定性，促進養殖系統各層次關系的持續平衡，使得病原在養殖系統多樣性機制中共存而不致病，減少病害暴發的不利因素。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基

芽孢菌富集培養基：蛋白胨5.00 g，葡萄糖10.00 g，酵母膏3.00 g，硫酸鎂0.50 g，磷酸氫二鉀0.50 g，氯化鈉0.20 g，加入1 L超純水混合均勻后調節pH至7.0～7.2，121 ℃滅菌15 min。

好氧反硝化菌富集培養基：磷酸二氫鉀1.50 g，硫酸鎂0.01 g，磷酸氫二鈉7.90 g，微量元素溶液2 mL，枸櫞酸鈉5.66 g，硝酸鈉0.84 g，加入1 L超純水混合均勻后調節pH至7.0～7.5，121 ℃滅菌15 min。

微量元素溶液：EDTA-2Na 50.00 g，ZnSO4·7H2O 3.93 g，CaC12·2H2O 7.28 g，MnC12·4H2O 5.06 g，FeSO4·7H2O 5.00 g，(NH4)6Mo7O2·4H2O 1.10 g，CuSO4·5H2O 2.45 g，CoC12·6H2O 1.61 g，加入1 L超純水混合均勻后調節pH至7.0。

1.1.2 固體發酵原料

豆粕、麩皮、米糠等購自當地飼料廠。

1.2 方法

1.2.1 菌群富集培養

采集各地養殖區域內豐產且少病害發生的養殖池塘水和底泥，進行芽孢桿菌和好氧反硝化菌群的富集培養。芽孢桿菌富集培養：取1 mL池塘水樣加入含9 mL富集培養基的試管中，28 ℃搖床培養24 h后，80 ℃水浴15～20 min，取100 μL樣品，在平板涂布，28 ℃培養24 h。好氧反硝化菌富集培養：取10 mL池塘水接種到裝有100 mL滅菌的富集培養基中，28 ℃、120 r·min-1培養2～3 d后備用。

1.2.2 池塘微型生物養護劑制備

富集培養菌液(菌液濃度大于1×109CFU·mL-1)混合池塘泥水，按照料水比1∶(0.6～1)加入到固體培養料(麩皮∶米糠∶豆粕5∶4∶1)中，混勻后堆放并用薄膜覆蓋。采用自然固體發酵方法進行發酵，觀察料溫變化，每天上午、下午各翻堆1次，使得料溫不超過50 ℃，固體發酵培養2～3 d，待培養料顏色變深、有發酵物的香味時，用薄膜袋分裝、密封，室溫放置幾天后備用。分別于不同發酵時間采集樣品，制備微型生物養護劑A、B，其中芽孢桿菌和反硝化菌含量均為106CFU·g-1。

1.2.3 池塘微型生物養護劑降氨作用的測定

試驗分為4組，每組3組平行，各5尾小規格羅非魚(體長2 cm)，飼養在氨氮含量為2.5 mg·L-1水中，水體中含有藻類、浮游動物、細菌等微型生物，每日投喂飼料，投喂量以食用完為準。處理1添加池塘微型生物養護劑A(添加量為0.02 g·L-1)，處理2添加池塘微型生物養護劑B(添加量為0.02 g·L-1)，處理3添加芽孢桿菌和好氧反硝化菌混合液(含芽孢桿菌、反硝化菌，各菌群濃度為>109CFU·mL-1)，處理4為空白對照。每日11:00采集各小組水樣，以比色法測定氨氮含量。

1.2.4 池塘微型生物養護劑的應用效果

在海南、廣東、河南、江蘇等地養殖池塘分別添加微型生物養護劑，根據當地養殖池塘情況，在晴天上午使用，每hm2使用劑量為15～30 kg，取5～10倍池塘水混合攪拌均勻后全池潑灑，2～5 d使用1次，并根據水體、氣溫等調節用量與間隔。使用護料后檢測養殖水體的水質情況。

2 結果與分析

2.1 微型生物養護劑品質檢測

采集特定養殖區域的豐產養殖池塘水、底泥，進行芽孢桿菌和好氧反硝化菌群的富集培養，經檢測，富集培養液中芽孢桿菌活菌數大于3.0×109CFU·mL-1，好氧反硝化菌群活菌數大于2.1×109CFU·mL-1。

在固體發酵培養時，經過48～72 h的固體發酵培養，培養物為棕黃色混合料，帶酸香味，經活菌檢測，芽孢桿菌和好氧反硝化菌群活菌數均大于1×106CFU·mL-1。

2.2 池塘微型生物養護劑的降氨作用

如表1所示，經連續4 d水體降氨氮模擬試驗觀察，與對照組相比，添加池塘微型生物養護劑A、B和添加芽孢桿菌和好氧反硝化菌混合液組水體中氨氮含量均下降到0.1 mg·L-1。試驗結果表明，添加微型生物養護劑對養殖水體中的氨氮具有良好的降低作用。

表1 不同處理對水體中氨氮濃度的影響

2.3 池塘微型生物養護劑的應用效果

在海南、廣東、河南、江蘇等地利用當地飼料原料，按照1.2.2制備池塘微型生物養護劑，使用效果如下。一是微型生物養護劑具有優化養殖池塘的微型生物多樣性的作用。海南文昌市昌灑鎮飼養羅非魚的池塘使用微型生物養護劑后，水體中藻類結構由貧營養型(2×104個·L-1)轉變為綠藻等有益藻類群落為主的中營養型(4×106個·L-1)；廣東中山民眾鎮飼養草魚的池塘使用微型生物養護劑后，水體中優勢藻類由裸藻門變為綠藻門，藻類密度增加，由使用前的3.17×105個·L-1增加為7.33×105個·L-1。二是微型生物養護劑具有維持養殖過程中水質穩定的作用。河南洛陽飼養鯉魚的池塘使用微型生物養護劑后，水體中氨氮含量由2.50 mg·L-1逐漸降低至0.02 mg·L-1，并保持較低水平。三是微型生物養護劑可降低魚死亡率。江蘇鹽城飼養草魚和鯽魚的池塘使用微型生物養護劑后，魚死亡量較對照組顯著下降(表2)。

表2 添加微型生物養護劑對魚群死亡量的影響

3 討論

水產養殖業常出現具有區域特征的大規模流行病，養殖水體環境惡化是發病的主要原因之一。為改善池塘養殖水體，維持良好的養殖水體環境，減少病害發生，降低抗生素等藥物使用，已有研究采用芽孢桿菌、硝化細菌、光合細菌、酵母菌、乳酸菌等有益微生物制劑改良養殖水體水質，取得了較好的效果[1-6]。同時，有研究采用生物絮團技術，通過調節池塘碳氮比，將池塘中積累的氮轉化為菌體蛋白，改善池塘水質，降低餌料系數[7-10]。芽孢桿菌、硝化及反硝化細菌具有較好的改善水質、降低氨氮含量的作用[11-16]，與此同時，在水體中加入外來微生物可能導致區域水體環境惡化。已有學者采用土著微生物來改善池塘養殖水體，并取得了較好的效果[17]。

本研究利用區域內高產、病害少的池塘優質養殖水體，富集培養得到芽孢桿菌和好氧反硝化菌等

土著菌群，添加到固體培養料，通過固體發酵培養，進一步擴大土著微生物量，制備微型生物養護劑并應用于該區域的池塘養殖中。本研究對如何維護養殖水體環境平衡進行了初步探索，但具體的作用機制等還需要進一步研究。