TJ-5 抑制ubch5c 介導NEMO 泛素化調控NF-κB 通路對MHD 患者體內微炎癥的影響

姚書東 吳 佳 羅文榮

維持性血液透析（maintenance hemodialysis，MHD）是終末期腎衰竭（ESRD）患者主要的治療手段[1]。在腎衰竭患者中普遍存在炎癥狀態，血液透析患者的不良后果部分歸因于該人群中普遍存在的炎癥狀態，并且相互影響，造成患者病癥加重及死亡[2]。近年來，雖然血液透析技術不斷更新，但最佳治療方案尚不確定，且需要長期持續治療，給患者及其家庭帶來持續性的經濟負擔[3]。本研究探討倍半萜內酯化合物TJ-5 對維持性血液透析患者微炎癥因子的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018 年2 月—2019 年2 月浙江中醫藥大學附屬湖州中醫院收治的選擇采用自體動靜脈內瘺為血管通路的維持性血液透析患者60例，所選患者均無心臟病史，無明顯心衰表現，為首次行動靜脈內瘺術。所有患者均給予常規降壓、糾正貧血等治療，透析液流量500mL/min，透析血流速200～300mL/min，鈣離子濃度1.5mmol/L，抗凝藥物為肝素鈉，使用低分子肝素抗凝，1 個月內治療方案固定，未行常規血液透析以外的血液凈化治療，每周2～3 次，每次4～4.5h。另選擇我院體檢中心健康體檢者20 名作為健康對照組。本研究經醫院倫理委員會審核通過，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入標準（1）參照2006 年美國腎臟病基金會制定的腎臟病生存質量指導指南（III.NKF-K/DOQI）[4]臨床明確診斷為終末期腎衰竭患者；（2）所有患者血清肌酐水平均＞707μmol/L，腎小球濾過率＜10%，符合尿毒癥的診斷標準[5]；（3）符合維持性血液透析診斷標準者且采用自體動靜脈內瘺為血管通路；（4）接受常規血液透析治療，患者臨床情況穩定，非透析時間血壓＞90/60mmHg（1mmHg=0.133kPa），透析齡＞3 個月；（5）無明顯肺部感染，血管通路感染。

1.3 排除標準（1）不符合診斷標準者；（2）維持性血液透析采用帶隧道帶滌綸套導管（TCC）及人工移植血管為血管通路；（3）MHD 治療＜3 個月；（4）臨床資料不全，失訪；（5）伴隨有嚴重感染，嚴重心、肺、肝臟疾病，心力衰竭、厭食癥以及惡性腫瘤患者；（6）因其他各種原因療程未結束退出試驗或死亡的病例；（7）療程中更換血液透析方式或透析器類型。

1.4 標本采集 透析結束后，清晨空腹留取受試者靜脈血，分別分離MHD 患者和健康志愿者外周血單一核細胞（PBMC），T 細胞分選試劑盒分離純化得到CD4+T 細胞，并進行鑒定。CD4+T 細胞使用不同濃度TJ-5 處理，將60 例MHD 患者血樣本分離純化得到的CD4+T 細胞分為空白組（0μM/mL TJ-5 處理）和高、低濃度組（10、5μM/mL TJ-5 處理），每組20 份，健康對照組20 份。

1.5 儀器及試劑 ELISA 試劑盒，批號kl-deim-05399，上海柯雷生物科技有限公司；細胞培養箱，型號：BC-J80/160S，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；流式細胞儀，型號：CytoFLEX LX，美國貝克曼庫爾特；蛋白印跡儀，型號：PROFIBLOT 48，帝肯（上海）貿易有限公司；移液槍（移液器套裝）；RPMI-1640 培養基，批號507767，GIBCO 公司；胎牛血清，批號11011-8613，杭州億楓生物公司。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 流式細胞術檢測MHD 患者外周血Th17/Treg比例 取清晨空腹留取受試者靜脈血，采用流式細胞儀檢測受試者外周血單核細胞Th17/Treg 比例，取受試者靜脈血分離單個核細胞，洗滌，離心后，分別加 入CD25-PE 抗 體、CD4-FITC 抗 體、CD127-PECY5 抗體及CD3-eFluor 660、CD8-FITC 抗體，避光、孵育、洗滌、離心，0.1%多聚甲醛固定液150μL 重懸細胞，使用流式細胞儀射門檢測，分選分析CD4+、CD25+、CD127low Treg 和CD3+、CD8-、IL17+TH17細胞比例。流式細胞儀按操作說明檢測，數據使用FlowJo 軟件分析。

1.6.2 ELISA 法檢測MHD 患者外周血CD4+T 細胞經TJ-5 處理后TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-10 表達水平 按各研究分組，裂解外周血CD4+T 細胞，試劑盒平衡至室溫（20～25℃）后，具體操作按ELISA 試劑盒說明書進行實驗，讀出OD450 值，計算外周血CD4+T 細胞腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）及白介素-10（IL-10）水平。檢測3 次，取平均值計算結果。

1.6.3 Western Blot 法檢測MHD 患者和健康志愿者外周血CD4+T 細胞P65、I-κB 及磷酸化P65、磷酸化I-κB 蛋白含量 裂解細胞后，提取細胞蛋白，進行SDS-PAGE 電泳，凝膠轉膜加一抗、二抗進行免疫反應。按說明書進行具體操作，測定外周血CD4+T 細胞核轉錄因子（P65）及磷酸化P65（p-P65）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，I-κB）及磷酸化I-κB（p-I-κB）蛋白含量，設置內參β actin 蛋白，進行分析。檢測3次，取平均值計算結果。

1.6.4 體外泛素化實驗檢測泛素連接酶（ubch5c）活性變化 參考文獻[4]的方法，裂解細胞后，取上清液，采用鎳柱親和純化獲得目的蛋白ubch5c，透析保存ubch5c，并檢測ubch5c 的純度，通過體外泛素化實驗檢測泛素連接酶ubch5c 活性變化情況。

1.6.5 免疫共沉淀法檢測NF-κB 必須調節蛋白（NEMO）線性泛素化 裂解CD4+T 細胞，離心等到蛋白后，加入anti-NEMO 抗體進行免疫共沉淀，根據Western Blot 法，加一抗anti-linear polyuiquitin 抗體進行免疫印跡，加anti-rabbit 熒光二抗后，用Odyssey檢測條帶，觀察NEMO 發生線性泛素化的情況[5]。

1.7 統計學方法 每個反應體系一式三份作為平行重復。實驗結束后，采用2-ΔΔCT 法計算待測目的基因的相對表達量。應用SPSS 22.0 統計軟件處理數據，數據以均數±標準差（）表示，兩組均數采用t檢驗，多組數據進行單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 MHD 組60 例，男34 例，女26 例，年齡（52.50±7.61）歲，其中慢性腎小球腎炎33 例，高血壓腎損害12 例，糖尿病腎病9 例，梗阻性腎病4 例，多囊腎2 例；血液透析時間均＞3 個月。健康對照組20 名，男11 名，女9 名，年齡（51.2±4.9）歲，血常規白細胞計數4～12×109，淋巴細胞及單核細胞比例正常，均有詳細病史，體格檢查、心電圖、胸部透視等檢查均無異常發現，無急慢性感染、高血壓、肝腎臟疾病、惡性腫瘤等疾病。兩組性別、年齡等比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 MHD 患者與健康志愿者外周血Th17/Treg 比例比較 與健康對照組比較，MHD 患者外周血Th17、Treg 水平增高，單核巨噬Th17/Treg 比例顯著上升（P均＜0.05）。見表1、圖1。

表1 MHD 患者與健康志愿者外周血Th17/Treg比例比較（%，）

表1 MHD 患者與健康志愿者外周血Th17/Treg比例比較（%，）

注：MHD 為維持性血液透析；Th17 為輔助性T 細胞17；Treg 為調節性T 細胞；與健康對照組比較，aP＜0.05

圖1 MHD 患者與健康志愿者外周血Th17 及Treg 比例

2.3 各組MHD 患者外周血TNF-α、Th17、IL-6、IL-10 及TFG-α 因子表達 與低濃度組比較，高濃度組TNF-α、IL-1β、IL-6 明顯下調（P 均<0.05），IL-10 明顯上調（P<0.05）；高、低濃度組TNF-α、IL-1β、IL-6表達量低于空白組，高于健康對照組，差異有統計學意義（P 均<0.05）；IL-10 表達量高于空白組和健康對照組（P 均<0.05）。見表2。

表2 各組MHD 患者與健康志愿者外周血CD 4+T 細胞炎性因子蛋白表達量比較（）

表2 各組MHD 患者與健康志愿者外周血CD 4+T 細胞炎性因子蛋白表達量比較（）

注：健康對照組為健康志愿者；空白組為0μM/mL TJ-5；低濃度組為5μM/mL TJ-5；高濃度組為10μM/mL TJ-5；MHD 為維持性血液透析；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-1β 為白介素-1β；IL-6 為白介素-6；IL-10 為白介素-10；與低濃度組比較，aP＜0.05；與空白組和健康對照組比較，bP＜0.05

2.4 各組MHD 患者和健康志愿者外周血CD4+T 細胞p65 和I-κB 表達及其磷酸化 與低濃度組比較，高濃度組CD4+T 細胞p65 蛋白表達及p-p65 明顯下調（P<0.05），I-κB 蛋白表達上調（P<0.05），p-I-κB明顯下調（P<0.05）；高、低濃度組p65 蛋白表達及pp65 低于空白組，高于健康對照組（P 均<0.05）；I-κB蛋白表達高于空白組，低于健康對照組（P 均<0.05），p-I-κB 低于空白組，高于健康對照組（P 均<0.05）。見表3、圖2。

表3 各組MHD 患者與健康志愿者外周血CD4+T 細胞p65和I-κB 表達及其磷酸化比較（）

表3 各組MHD 患者與健康志愿者外周血CD4+T 細胞p65和I-κB 表達及其磷酸化比較（）

注：健康對照組為健康志愿者；空白組為0μM/mL TJ-5；低濃度組為5μM/mL TJ-5；高濃度組為10μM/mL TJ-5；MHD 為維持性血液透析；p65 為轉錄因子NF-kB 成員之一；p-p65 為磷酸化p65；I-κB 為核因子κB 的抑制蛋白；p-I-κB 為磷酸化核因子κB 抑制蛋白；與低濃度組比較，aP＜0.05；與空白組和健康對照組比較，bP＜0.05

圖2 MHD 患者與健康志愿者外周血CD4+T 細胞p65 和I-κB 表達及其磷酸化

2.5 各組MHD 患者和健康志愿者外周血CD4+T 細胞ubch5c 活性抑制率比較 TJ-5 高濃度組CD4+T細胞ubch5c 活性抑制率明顯高于低濃度組、空白組和健康對照組（P 均<0.05）。見表4、圖3。

2.6 各組MHD 患者和健康志愿者外周血CD4+T 細胞NEMO 泛素化率比較 與低濃度組比較，高濃度組CD4+T 細胞NEMO 泛素化率明顯下調（P 均<0.05）；高、低濃度組CD4+T 細胞NEMO 泛素化率低于空白組，高于健康對照組（P 均<0.05）。見表5、圖4。

表4 各組MHD 患者和健康對照志愿者外周血CD4+T 細胞ubch5c 活性抑制率比較（%，）

表4 各組MHD 患者和健康對照志愿者外周血CD4+T 細胞ubch5c 活性抑制率比較（%，）

注：健康對照組為健康志愿者；空白組為0μM/mL TJ-5；低濃度組為5μM/mL TJ-5；高濃度組為10μM/mL TJ-5；MHD 為維持性血液透析；與低濃度組比較，aP＜0.05；與空白組和健康對照組比較，bP＜0.05

圖3 MHD 患者與健康志愿者外周血CD4+T 細胞ubch5c 活性變化

表5 各組MHD 患者和健康對照志愿者外周血CD4+T 細胞NEMO 泛素化率比較（%，）

表5 各組MHD 患者和健康對照志愿者外周血CD4+T 細胞NEMO 泛素化率比較（%，）

注：健康對照組為健康志愿者；空白組為0μM/mL TJ-5；低濃度組為5μM/mL TJ-5；高濃度組為10μM/mL TJ-5；MHD 為維持性血液透析；NEMO 為NF-κB必須調節蛋白；與低濃度組比較，aP＜0.05；與空白組和健康對照組比較，bP＜0.05

圖4 MHD 患者與健康志愿者外周血CD4+T 細胞NEMO 線性泛素化

3 討論

微炎癥狀態是指人機體在各種內毒素、免疫復合物等刺激下，單核巨噬細胞系統被激活，表達和分泌促炎癥細胞因子，緩慢發生并持續存在的免疫性炎癥，是導致MHD 患者發生并發癥的主要因素，且減弱患者腎功能和透析充分性[6-7]。張倫等[8]研究也表明淋巴細胞比例影響MHD 患者的健康狀況。

本實驗發現，通過與健康志愿者進行比較，MHD患者外周血Th17、Treg 水平增高，單核巨噬Th17/Treg 顯著上升（P 均<0.05），且各炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-10 均升高（P 均<0.05）。經過倍半萜內酯化合物TJ-5 處理可有效抑制CD4+T 細胞促炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 分泌，并促進抗炎性因子IL-10 上調，減弱免疫性炎癥。

當CD4+T 細胞受到外界因素刺激后，I-κB 被磷酸化并降解，激活CD4+T 細胞經典的NF-κB 信號通路，P65 在細胞質和細胞核中可被磷酸化，磷酸化的P65 更容易與特異性啟動的靶基因結合促進IL-6、TNFα、IL-1β 等炎性細胞因子轉錄，并抑制IL-10 等抑炎性細胞因子的轉錄，發揮協同作用，對于炎癥反應的發生發展相當重要[9-10]。實驗表明，經過倍半萜內酯化合物TJ-5 處理后，CD4+T 細胞p65 表達及其磷酸化明顯下調（P 均<0.05），I-κB 表達上調（P<0.05），其磷酸化明顯下調（P<0.05），CD4+T 細胞NF-κB 信號通路被抑制，但還無法恢復到正常水平。

核因子NF-κB 必需調節劑（NEMO）是NF-κB 信號傳導中的關鍵調節因子，通過傳遞細胞外或細胞內信號，可以控制NF-κB 調節的基因[11-12]。ubch5c 是TNF-α 觸發的核因子κB（NF-κB）激活過程中催化NEMO 泛素化的關鍵泛素酶之一[13-14]。α-santonin 衍生的ubch5c 抑制劑TJ-5 是一種先導化合物，用于炎性和自身免疫疾病的治療，TJ-5 通過與ubch5c 活性位點Cys85 形成共價加合物而優先結合并滅活ubch5c[15-18]。本研究表明，倍半萜內酯化合物TJ-5 抑制ubch5c 酶活性，減弱NEMO 線性泛素化，調控CD4+T 細胞NF-κB 通路表達分泌IL-6、TNFα、IL-1β 等炎性細胞因子。

倍半萜內酯化合物TJ-5 現主要以體外及動物實驗為主，臨床研究還較少，對于具體療效及安全程度尚未知悉，需要更深入研究調查，以望為血液透析患者提供更優質、經濟實惠的治療方案，提高透析患者的生存質量。