抑制高遷移率組蛋白1 對大鼠急性脊髓損傷后炎性反應的影響

呂建蘭 胡勁濤 柴 樂 錢劍勝 任偉凡 全仁夫

急性脊髓損傷（acute spinal cord injury，ASCI）可導致損傷平面以下各種運動、感覺和神經功能障礙，是一種嚴重的中樞系統損傷，其治療是世界性臨床醫學難題[1-2]。本研究應用改良Allen’s 法[3]制備大鼠急性不完全脊髓損傷模型，探討抑制高遷移率組蛋白（high mobility group box-1 protein，HMGB1）對大鼠ASCI 炎癥反應的影響，報道如下。

1 實驗材料

1.1 動 物 清潔級雄性Wister 大鼠32 只，體質量（150±20）g，購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司[動物使用許可證號：SCXK（滬）2017-0005]，由浙江中醫藥大學實驗動物中心（SPF）分籠飼養，每籠4只，溫度20～24℃，濕度50%～70%，適應性飼養1 周后進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器 HMGB1 抑制劑甘草酸干粉1g/瓶（MB6641，大連美侖生物技術有限公司，大連）、RIPA 裂解液（普利萊基因技術有限公司，北京）、HMGB1 酶聯免疫檢測試劑盒（E181174）、核轉錄因子κB（NF-Kbp65）酶聯免疫檢測試劑盒（E181213）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫檢測試劑盒（E189043）、白介素-6（IL-6）酶聯免疫檢測試劑盒（E190068）、白介素-1β（IL-1β）酶聯免疫檢測試劑盒（E189705）（均購自Assay 公司，美國）、TaKaRa 試劑盒（RR047A，Invitrogen 公司，美國）、Trizol 試劑（15596026，Invitrogen 公司，美國）；10g 克氏針（江蘇金鹿醫療器械公司，ZX105），勻漿器（江蘇金偉實驗儀器），Bio-Tek ELX800 全自動酶標儀（Thermo Scientific Varioskan Flash），Step one plus PCR 儀（ABl，美國）。

2 實驗方法

2.1 脊髓損傷模型建立 應用改良Allen's 法制備急性不完全性脊髓損傷模型大鼠，實驗順序隨機進行。大鼠稱重后用3%戊巴比妥鈉（1.5mL/kg）[4]腹腔注射麻醉，待大鼠無四肢反應后將其俯臥于操作臺上，取背部T9-T11 正中切口，鈍性分離椎旁肌肉，咬除T10 棘突及全部椎管，暴露0.5cm 寬硬膜，用自制的改良打擊裝置（質量為10g 的克氏針沿帶有刻度的透明管從60mm 高處垂直自由下落，致傷量為60g/cm）造成脊髓中度損傷，使大鼠出現痙攣性擺動、擺尾反射，致傷后迅速移開打擊物，逐層縫合切口，大鼠出現雙下肢遲緩性癱瘓，運動功能評分（BBB）評分<2 分，證明造模成功[5-6]。術后每天注射青霉素80U 預防感染，連用3 天；每天2 次人工膀胱按摩協助排尿。

2.2 分組及給藥 選擇健康雄性Wister 大鼠32只，按隨機數字表法分為正常組、假手術組、模型組、甘草酸組，每組8 只。假手術組大鼠只咬除T10 棘突和椎板，不損傷脊髓；模型組和甘草酸組大鼠按上述造模法損傷脊髓，模型組大鼠術后正常飼養，不做其它處理，甘草酸組大鼠術后給予甘草酸（溶于生理鹽水，200mg/kg）灌胃處理，每天1 次，連用3 天[7]，實驗過程無大鼠死亡。術后3 天，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1.5mL/kg），待動物麻醉后于冰上迅速剪取以傷段為中心上下各0.5cm 節段脊髓組織存入-80°冰箱，用于ELISA 檢測和qRT-PCR 檢測。

2.3 檢測指標及方法

2.3.1 ELISA 檢測大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6 及IL-1β 表達量 按照大鼠HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 酶聯免疫檢測試劑盒使用說明書進行操作，采用生物素雙抗夾心技術檢測脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。簡要實驗步驟：準備試劑（生物素標記的抗HMGB1抗體、抗NF-κB 抗體、抗TNF-α 抗體、抗IL-6 抗體、抗IL-1β 抗體、鏈霉親和素-HRP），將標準品梯度稀釋；加入準備好的樣品、標準品、生物素標記二抗和酶標試劑，37℃反應1h；洗板5 次，加入顯色液A、B，37℃避光顯色10min；加入終止液終止反應；10min內讀取各孔的吸光度（OD 值）。根據標準液的檢測結果得出標準曲線，求出各組樣品的實際濃度。

2.3.2 qRT-PCR 法檢測大鼠脊髓組織HMGB1、NFκB、TNF-α、IL-6 及IL-1β mRNA 表達量 采用Trizol 法分組提取總RNA，檢測RNA 濃度及純度。按照TaKaRa 試劑盒說明書進行反轉錄反應，以待檢測基因的引物為模板，采用Step one plus PCR 儀進行熒光定量PCR 檢測，以β-actin 作為內參進行相對定量分析。大鼠脊髓損傷區HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 引物序列由上海生工生物技術合成提供。HMGB1：上游5'-ATGGGC-AAAGGAGATCCTA-3'，下游5'-ATTCTCATCATCT-CTTCT-3'；NFκB：上游5'-CGATCTGTTTCCCCTC-ATCT-3'，下游5'-ATTGGGTGCGTCTTAGTGGT-3'；TNF-α：上游5'-CCAACAAGGAGGAGAAGTTCC-3'，下游5'-CTCTGCTTGGTGGTTTGCTAC-3'；IL-6：上游5'-CTACGAAGAACTGGCAATATG-3'，下游5'-AAACCATCTGGCTAGGTAAGA-3'；IL-1β：上游5'-GACTTCACCATGGAACCCGT-3'，下游5'-GGAGACTGCCCATTCTCGAC-3'；β-actin：上游5'-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3'，下游5'-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3'。

2.4 統計學方法 應用SPSS 20.0 統計軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（）表示，正態資料采用單因素方差分析，兩兩比較應用LSD 法（方差齊）或Tunnett T3 法（方差不齊），非正態資料采用秩和檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達量比較 ELISA 結果顯示，脊髓損傷大鼠的HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平較未脊髓損傷大鼠高（P 均＜0.01）；脊髓損傷后，甘草酸灌胃處理大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNFα、IL-6、IL-1β 水平較模型組低（P 均＜0.01）。見表1。

3.2 各組大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA 表達量比較 qRT-PCR 結果顯示，脊髓損傷大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNFα、IL-6 和IL-1β mRNA 表達水平較未脊髓損傷大鼠高（P 均＜0.01）；脊髓損傷后，甘草酸灌胃處理大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA 表達水平較模型組低（P 均＜0.05）。見表2。

4 討論

ASCI 的病理過程包括原發性損傷和繼發性損傷。原發性損傷是由強大外力導致的初次損傷，包括壓迫和挫裂傷。繼發性損傷是在原發性損傷的基礎上，機體隨后出現的一系列病理、生化反應，主要包括炎性反應、細胞凋亡等。脊髓原發性損傷后隨之而來的繼發性損傷是導致殘余神經通路受損和功能喪失的重要原因，炎性反應是繼發性脊髓損傷微環境改變的主要成分，在ASCI 的病理生理學機制中處于中心地位，但對于是何種分子啟動了ASCI 后的炎性反應仍有待研究[8-9]。

表1 各組大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB 及相關炎性因子水平比較（pg/mL，）

表1 各組大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB 及相關炎性因子水平比較（pg/mL，）

注：正常組和假手術組無脊髓損傷；模型組和甘草酸組有脊髓損傷，甘草酸組在脊髓損傷后予甘草酸灌胃處理，模型組無特殊處理；HMGB1 為抑制高遷移率組蛋白；NF-κB 為核轉錄因子κB；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白介素-6；IL-1β 為白介素-1β；與正常組、假手術組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

表2 各組大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB 及相關炎性因子mRNA 表達量比較（×10-3，）

表2 各組大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB 及相關炎性因子mRNA 表達量比較（×10-3，）

注：正常組和假手術組無脊髓損傷；模型組和甘草酸組有脊髓損傷，甘草酸組在脊髓損傷后予甘草酸灌胃處理，模型組無特殊處理；HMGB1 為抑制高遷移率組蛋白；NF-κB 為核轉錄因子κB；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白介素-6；IL-1β 為白介素-1β；與正常組、假手術組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

HMGB1 作為一類高度保守的DNA 結合蛋白，穩定存在于正常組織細胞核內，當受到損傷、炎癥等理化因素刺激后，組織細胞缺血缺氧，大量的HMGB1可被動/主動的釋放至細胞外，與神經元細胞、星形膠質細胞的表面受體結合，即可啟動信號轉導通路，激活核轉錄因子NF-κB，通過誘導TNF-α 及IL-6，在炎癥的級聯反應中發揮重要調節作用[10-11]。

NF-κB 幾乎存在于脊髓組織所有的細胞中，其最主要的功能是調控炎性相關基因的轉錄。脊髓損傷致細胞受刺激后，通過NF-κB 信號通路的活化引起ASCI 后炎性反應以及繼發性神經損害，TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎性因子都受NF-κB 的調控[12-14]。ASCI 后的局部缺血、低氧等應激因素導致IKB 的磷酸化，引起NF-κB 活化，激活NF-κB 信號通路，通過上調編碼炎癥相關因子基因的表達，誘導基因轉錄，增加炎性介質的合成和釋放，而這些炎性介質又反過來激活NF-κB 信號通路，形成的細胞外正反饋調節，可放大炎癥效應，加重ASCI 后神經損傷[15]。HMGB1 依賴性的NF-κB 信號通路可能參與脊髓損傷后的炎性反應。HMGB1 作為危險信號分子及炎癥介質，可以介導一系列重要的生物學功能，包括觸發炎癥、以及促進細胞的生長、發育、增殖、凋亡等過程[16-17]。現研究表明，甘草酸可抑制細胞內HMGB1的釋放和細胞外HMGB1 活性，對神經起重要保護作用，Kim 等[18]研究發現，甘草酸可通過抑制HMGB1分泌而發揮抗炎作用，對腦神經具有保護作用。Gu等[19-20]也發現甘草酸的抗炎作用可減輕大鼠缺血性脊髓損傷和腦缺血再灌注損傷。

炎性反應是造成ASCI 后不可逆損害的重要病理基礎之一。HMGB1 及其受體在中樞神經系統廣泛表達，在脊髓損傷后繼發的炎癥、凋亡及神經功能恢復中起著重要作用，HMGB1 是改善脊髓損傷后神經功能的新穎治療靶點[21]。本實驗前期預實驗結果提示，ASCI 后3 天，受損脊髓組織HMGB1 表達出現峰值，參考相關文獻[7]，給甘草酸組大鼠行甘草酸灌胃處理，通過ELISA 和RT-qPCR 檢測結果顯示，模型組和甘草酸組大鼠，由于脊髓遭受急性損傷，脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 蛋白及其mRNA 表達量較正常組和假手術組明顯增加；但是，在脊髓損傷后使用甘草酸，大鼠脊髓組織HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 蛋白水平及其mRNA 表達量較未使用甘草酸的模型組降低。我們推測HMGB1 至少部分參與介導ASCI 的炎性反應,并與HMGB1 依賴的NF-κB 信號通路密切相關。