干細胞局部應用對缺損面神經再生效果的系統評價

趙丹 李月恒 楊正艷 蔡婷 吳曉艷 夏雨 周智

重慶醫科大學附屬口腔醫院預防口腔科 口腔疾病與生物醫學重慶市重點實驗室重慶市高校市級口腔生物醫學工程重點實驗室，重慶 401120

面神經是以運動神經為主的混合神經，主要支配面部表情肌和傳導舌前2/3的味覺及支配舌下腺、下頜下腺和淚腺的分泌[1]。面神經損傷是頜面部較常見的損傷類型之一。腮腺腫瘤手術、創傷和巖骨手術等均有可能傷及面神經[2]。面神經損傷可引起面部肌肉運動障礙，導致額紋消失、眼瞼閉合不全、鼻唇溝消失、鼓腮無力、口角下垂及流涎等功能障礙[1]，給患者帶來極大的心理壓力。面神經斷裂后，可通過吻合神經斷端的方式對其進行修復。然而，當神經缺損較多、縫合張力過大時，首先是要縮小缺損間隙。雖然許多現代顯微外科技術可用于面神經修復，但其對面部功能的修復效果有時仍不能令人滿意，甚至有可能產生骨性麻痹綜合征[3]。自體神經移植一直都是修復神經缺損的金標準[4]。然而，自體神經移植技術也存在供體神經數量有限、瘢痕形成、傷口感染、傷口疼痛、手術時間相對較長等局限性。因此，為臨床醫務人員及患者提供行之有效的修復面神經缺損的方法是一個亟待解決的問題。

基因和組織工程的應用使學者們聯想到使用神經組織工程技術進行面神經修復。神經組織工程主要包括三個方面：人工神經導管、神經生長因子和細胞[5]。在過去的二十年里，使用干細胞修復周圍神經損傷持續受到學者們的關注[6]。干細胞是一類具有多向分化潛能和自我復制能力的原始未分化細胞，是形成哺乳類動物各組織器官的原始細胞[7]。干細胞主要通過發揮抗炎作用，分泌生長因子，替代雪旺細胞（Schwann cells，SCs）和運動神經元等方式促進神經再生[6]。神經干/祖細胞（neural stem/progenitor cells，NS/PCs）在治療神經性疾?。ㄈ缂顾钃p傷，腦損傷，周圍神經損傷）方面具有應用前景[8-9]。神經干細胞（neural stem cells，NSCs）具有以下特征：1）具有多向分化潛能及可形成3種成熟的神經細胞（神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞）；2）在神經組織損傷后產生同源的新細胞；3）可以被連續移植；4）可以自我更新[10]。由于SCs能夠促進髓鞘的形成，因此其在神經再生過程中起著重要的作用[11]。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種能分化為雪旺樣細胞的多能成體干細胞[12-14]，常見的為脂肪間充質干細胞（adiposederived stem cells，ADSCs）和骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），分別是來源于脂肪組織和骨髓的多能成體干細胞。充足的來源、易獲得性、能快速增殖、可多向分化及易于與宿主整合等特點，使得其成為促進神經再生的一個理想的細胞來源[12,14]。脂肪來源、骨髓來源、海馬神經來源的干細胞促進周圍神經再生的實驗已取得理想的結果[15-16]。其他來源的干細胞，如牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、牙齦間充質干細胞（gingiva-derived mesenchymal stem cells，GMSCs）、人類嗅黏膜干細胞（human olfactory stem cells，HOSCs）、基質血管成分細胞（stromal vas cular fraction，SVF）在動物模型上也收到了令人滿意的神經再生效果[7,17-20]。

雖然關于干細胞促進面神經再生的基礎實驗取得了令人滿意的結果，但人們仍不能確定干細胞是否能夠真正有效地促進面神經再生，是否有必要對這一領域進行進一步探索，且需要后效評估以往實驗中動物模型的使用是否得當，降低將動物實驗所獲得的結果引入臨床的風險。因此，有必要針對干細胞是否能夠促進動物面神經再生這一問題進行系統的評價。本文的主要目的即為系統地評價干細胞對面神經缺損的組織學修復效果。

1 材料和方法

本研究系統評價是遵照系統評價和Meta分析優先報告的條目（Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta Analyses，PRISMA）的規范來制定的[21]。

1.1 注冊

參與研究的人員在實施系統評價前制定了詳細的計劃書，于2018年10月25日在PROSPERO網站（https://www.crd.york.ac.uk/prospero/）提交注冊申請，11月16日注冊成功。注冊編號是CRD42018113065。

1.2 納入及排除標準

根據本系統評價的目的，研究人員制定了如下標準來選擇合適的研究。納入標準：1）關于干細胞促進面神經再生的研究；2）主要干預措施為干細胞；3）神經完全斷裂的研究；4）動物實驗。排除標準：1）未達到納入要求的研究；2）主要干預措施不是干細胞；3）神經拉傷等無缺損的研究；4）主要修復對象不僅為面神經，還包括周圍組織的研究；5）動物實驗以外的研究（病例報告、綜述、評論等）；6）體外研究；7）無法獲得全文的研究；8）數據結果不可靠的研究；9）重復報告。

1.3 檢索策略

為了全面廣泛地搜集原始資料，研究人員在Pubmed、Cochrane Library、Web of Science、Embase、Scopus及中國生物醫學文獻數據庫檢索了2018年10月25日前的所有原始研究。在英文數據庫中，將干細胞與面神經及面神經缺損的各種英文表達方式作為關鍵詞，使用布爾邏輯“AND”進行檢索。中文檢索式：干細胞和面神經。同時，研究人員手工檢索了所納入研究的參考文獻。

1.4 數據提取及合成

由2名專業的篩選者各自獨立完成文獻篩選工作。首先運用EndNote X8軟件查找并排除重復文獻；再由2名篩選者閱讀文獻的題目和（或）摘要，行初步篩選；最后，2名篩選者閱讀剩余文獻全文行進一步篩選，同時標注文獻排除的理由。當2人對文獻是否納入（或排除）存在爭議時，通過征求第三方專業人員的意見達成了共識。對所有納入的研究進行了描述性分析，將實驗組使用導管和干細胞、對照組（非干細胞組）僅使用導管，且2組均含有可用數據的研究納入Meta分析。針對有多個隨訪時間的研究，僅提取最后時間點的數據。當結果以圖形而非具體數據的形式展現出來的時候，使用GetData Graph Digitizer 2.26軟件提取出了所需數據。當原始研究中未給出具體的標準差信息時，使用給定的標準誤、可信區間、t值、P值等信息進行標準差的推斷[22]。對于使用各種方法仍無法獲得標準差、均數及各組樣本量等具體信息的研究，不納入Meta分析。當研究設立多個以干細胞為干預措施的實驗組時，將各實驗組視為亞組，并對亞組數據進行整合形成一個實驗組。若出現一個以上對照組，按同樣方法處理[22]。使用四舍五入法保留兩位小數。

1.5 偏倚風險評估與質量評價

2名研究人員采用動物實驗系統評價研究中心（the Systematic Review Centre for Laboratory Animal Experimentation，SYRCLE）的動物實驗偏倚風險評估工具[23]，按照低風險、高風險及不確定風險對每一篇納入的研究獨立進行偏倚風險評估及質量評價。

1.6 數據分析

采用RevMan 5.3軟件及隨機效應模型進行統計分析，結果以均數差（MD）及95%可信區間（confidence interval，CI）的形式呈現。

對面神經的功能性評估（胡須運動評分、面癱評分）及組織學評估（有髓纖維密度、纖維直徑、髓鞘厚度、G比值）結果進行Meta分析，其中有髓纖維密度是指在100 000 mm2下有髓纖維的數目。使用I2對異質性的大小進行分析，I2＜25%被視為低異質性，I2＜50%異質性可以被接受，I2＞75%被視為高異質性。

2 結果

2.1 檢索結果

從6個數據庫中共檢索出4 614篇文獻，去除重復研究后剩余3 580篇。閱讀題目和（或）摘要去除3 534篇，另有7篇研究無法獲取全文而排除，剩余39篇文獻，閱讀全文后排除7篇，其中2篇未詳細報告實驗方法，2篇數據雷同而不真實，1篇研究結果無數據及圖片等證據，1篇為人體研究，1篇為網狀神經缺損。剩余32篇文獻被納入研究，通過手工檢索納入研究的參考文獻，未發現32篇研究以外符合納入標準的研究。32篇中，15篇研究被納入Meta分析。

2.2 研究特征

各研究的基本情況存在明顯的差異。32篇原始研究使用了不同動物類型的面神經缺損模型。大鼠是最受青睞的動物（SD大鼠11篇，Lewis大鼠7篇，Wistar大鼠3篇），其次是兔子（新西蘭白兔8篇，家兔1篇），最后是狗和豚鼠（各1篇）。在32篇研究中，可以確定的動物數目為1 032只，其中有2篇研究未明確報道動物數目。在各研究中，動物的年齡、性別、體重等存在差異，有一些研究未報道動物基線特征的完整信息。各研究人為地去除部分面神經主干或分支以形成動物面神經缺損模型。其中多以面神經頰支的破壞為主（23篇），其次依次為面神經主干（5篇）、面神經下頜緣支（2篇）、面神經顳支（1篇）及混合型破壞（1篇）。動物模型中神經間隙的長度在零至十幾毫米不等，以5～10 mm為最多（20篇），另有7篇未明確缺損長度或只給出了所切除神經的長度而非神經切除并收縮之后所留下的間隙長度。其中，0 mm表示神經切斷后進行的是神經吻合術。32篇研究主要采用了3種神經修復方法。神經導管修復神經缺損是最常用的方法（27篇），其他方法有神經吻合修復（3篇）、神經移植修復（1篇）、自體筋膜修復（1篇）。使用的導管有硅膠導管（10篇），聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）導管（3篇），去細胞動脈導管（2篇），靜脈導管、去細胞坐骨神經導管、殼聚糖導管、膠原導管、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）導管、Gore-Tex導管、Axo-Guard導管、羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）-膠原導管、PGA-膠原導管和3D打印導管（各1篇），另有2篇未注明使用的導管類型。干細胞的類型包括：脂肪源性細胞（9篇），BMSCs、神經源性細胞、牙髓干細胞（各6篇），MSCs（2篇），SVF、神經引導的人間充質干細胞（neural-induced human mesenchymal stem cells，N-iHMSCs）（各1篇）。使用的細胞劑量以1×105～10×105（15篇）為最多，另有1篇使用了1×103、1×105、1×107作為實驗組細胞劑量，7篇未報道細胞劑量（7篇）。回訪時間數天到數月不等，以8～16周（23篇）為最多，另有1篇未報道隨訪時間。所進行的組織學評估包括有髓纖維密度、纖維直徑、髓鞘厚度、G比值。納入研究的基本信息見表1。

2.3 偏倚風險評估

偏倚風險評估的結果見圖1。

多數研究缺乏保證動物實驗質量的關鍵信息。所有研究均未提到“分配隱藏”和“隨機分組”，存在高風險。個別研究提到“實施者施盲”、“隨機結果評估”及“評估者施盲”等，但未詳細闡述具體方法。僅少數研究闡述了“隨機序列產生”的具體方法。關于“基線特征”，多數研究對其做了交代，但其中一些研究未同時報道年齡、性別和體重三者的信息。一些研究未報告術后動物存活情況，結局數據不完整。“選擇性結果報告”這一方面較為理想，多數研究不存在這一隱患。多數研究提到了倫理、基金支持、利益沖突其中之一，在“其他風險”這一方面存在著不確定風險。

2.4 Meta分析

15篇研究被納入Meta分析，可確定的動物總量為719只。由于并不是所有的動物都會做每一項檢測，因此Meta分析以該項檢測對應的動物數目為相應組分的樣本量。

2.4.1 胡須運動評分 5篇文獻使用了胡須運動評分量表對面神經的功能進行了評估。Meta分析結果顯示，實驗組的胡須運動評分高于對照組（MD=0.81，95%CI 0.25～1.37，P=0.005），但存在明顯的異質性（I2=86%，P＜0.000 1）（圖2）。

圖1 偏倚風險評估Fig 1 Risk of bias assessment

圖2 2組胡須運動評分的Meta分析Fig 2 Meta-analysis of the score of vibrissae movement

2.4.2 面癱評分 3篇文獻使用了面癱評分量表對面神經的功能進行了評估。Meta分析結果顯示，實驗組的面癱評分高于對照組（MD=1.39，95%CI 1.20～1.58，P＜0.000 01），無明顯異質性（I2=0，P=0.56）（圖3）。

圖3 2組面癱評分的Meta分析Fig 3 Meta-analysis of the score of facial paralysis

2.4.3 有髓纖維密度 5篇文獻對有髓纖維密度進行了評估。Meta分析結果顯示，實驗組的有髓纖維密度高于對照組（MD=81.32，95%CI 28.32～134.32，P=0.003），但異質性過大（I2=94%，P＜0.000 01）（圖4）。

2.4.4 纖維直徑 6篇文獻對纖維直徑進行了評估。Meta分析結果顯示，實驗組和對照組的纖維直徑無統計學差異（MD=1.25，95%CI -0.15～2.66，P=0.08），且同時存在明顯的異質性（I2=98%，P＜0.000 01）（圖5）。

2.4.5 髓鞘厚度 11篇文獻對髓鞘厚度進行了評估。Meta分析結果顯示，實驗組的髓鞘厚度大于對照組（MD=0.16，95%CI 0.10～0.23，P＜0.000 01），但存在明顯的異質性（I2=88%，P＜0.000 01）（圖6）。

2.4.6 G比值 7篇文獻對G比值進行了評估。Meta分析結果顯示，實驗組的G比值小于對照組（MD=-0.06，95%CI -0.10～-0.02，P=0.001），但存在一定的異質性（I2=43%，P=0.10）（圖7）。

圖4 2組有髓纖維密度的Meta分析Fig 4 Meta-analysis of the density of myelinated fibers

圖5 2組纖維直徑的Meta分析Fig 5 Meta-analysis of the diameter of fibers

圖6 2組髓鞘厚度的Meta分析Fig 6 Meta-analysis of the myelination thickness

圖7 2組G比值的Meta分析Fig 7 Meta-analysis of the G ratio

3 討論

關于干細胞促進面神經再生的研究現還局限于動物模型及體外研究，鮮有關于干細胞促進面神經再生的臨床研究。人們仍不能夠確定干細胞對面神經的修復效果究竟如何，其是否有希望被應用于臨床，如何加快其應用于臨床的進程。目前除了Euler de Souza Lucena等[2]寫過一篇關于干細胞與組織工程修復面神經的系統評價外，并沒有關于此方面的其他系統性總結。受當時文獻數目的限制，Euler de Souza Lucena等[2]僅進行了定性描述，而無定量分析。其后有許多新的基礎研究被報道出來，因此有必要針對干細胞對面神經再生的效果進行一次新的系統性評價。

動物模型中評估面神經再生情況的方法主要為功能性評估、電生理學評估及組織學評估。本研究中發現，關于面神經再生的電生理學評估研究非常有限，且測量方法存在不容忽視的差異。因此，本系統評價僅對面神經的功能性評估（胡須運動評分，面癱評分）及組織學評估（有髓纖維密度，纖維直徑，髓鞘厚度，G比值）結果進行Meta分析。其中，G比值代表纖維成熟的程度，在一定范圍內越小代表纖維的成熟度越高。本研究結果顯示，干細胞組的胡須運動評分、面癱評分、有髓纖維密度、髓鞘厚度均高于非干細胞組（P＜0.05），G比值小于非干細胞組（P=0.001）。無論是功能性評估結果，還是組織學評估結果，都支持干細胞促進面神經再生的這一理論，證實了干細胞在促進面神經再生方面具有潛在的作用。

面神經再生的關鍵在于新軸突及髓鞘形成、神經重新支配靶器官。其中SCs是神經再生及功能恢復中不可或缺的重要角色[48-49]。它們產生包括神經生長因子、腦源性神經營養因子及grial-cell-line源性神經營養因子在內的營養因子及軸突再生不可或缺的黏性細胞外基質[50]。神經損傷后，SCs由髓鞘型轉化為生長型，進而增殖并形成Bungner帶以引導軸突再生到原來的位置[51]。神經完全斷裂要比非完全斷裂難以修復得多，因為神經離斷后，斷端會向兩端收縮從而形成間隙[52-53]，炎癥細胞遷移到損傷部位，并在局部缺氧的情況下分泌血管內皮生長因子，刺激早期內皮細胞的生長[54-56]。之后SCs脫離神經干并利用新形成的血管網引導軸突由一端向另一端生長[34-36]。然而，提取過程產生的疼痛、供體部位的發病及體外細胞培養的難度無一不限制了SCs在臨床的應用[57]。目前干細胞被視為神經再生的重要替代來源。

NSCs被視為一種有前途的細胞，其由胚胎或成年哺乳動物的腦分離而來，并能夠分化為成熟神經元、星形膠質細胞或少突膠質細胞[11,58-59]。然而，NSCs的應用受到宿主組織中細胞存活率低的限制。有學者將NS/PCs移植到宿主損傷部分，在最初的幾周里其活細胞的數量竟降低至4%以下[60-61]。ADSCs和BMSCs均為多能間充質干細胞，可分化為中胚層或外胚層來源的組織[62-65]。ADSCs和BMSCs可以通過較小的侵入性程序獲得，以較高的增殖率培養，轉分化為SCs，促進髓鞘形成，是細胞移植及促進周圍神經再生的優先選擇[63,66]。通過重組成體細胞形成的多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是干細胞領域的另一項重要技術[67-68]。有學者已經利用iPSCs細胞系獲得了功能和表型正常的運動神經元[67,69-73]。

人們對其他來源干細胞的研究也在不斷完善，不斷地有新的理論及觀點涌出。近年來，3D打印技術在組織修復領域內的應用變得逐漸廣泛，也不乏使用3D打印技術結合干細胞成功進行神經再生的案例[19,74]。Zhang等[19]通過3D打印無纖維神經導管結合GMSCs實現了大鼠缺損面神經的再生。使用GMSCs細胞團引導生成的3D神經導管，不僅表達了神經標志物β-微管蛋白Ⅲ和SCs標志物S-100β，而且表現出接近于自體神經移植的缺損面神經修復效果。然而，使用3D打印技術進行面神經修復仍然存在一些的問題，例如需要：優化細胞團培養的時間及培養基，對該技術所修復的神經進行功能性評估，驗證該技術是否具有可重復性，對細胞的作用進行追蹤，評估該技術結合各種神經導管對神經的修復效果[19]。因此未來的研究有必要針對以上問題進行探索，尤其是需要比較3D打印神經導管與自體神經移植的功能性修復效果。

本文的系統評價研究結果表明，干細胞具有促進面神經再生的趨勢。然而想要得出確切的結論，尚需要對這一領域進行進一步探索。建議今后的研究設計，應兼顧對神經修復的功能性、組織學及電生理學方面的評估；設立陽性對照（如自體神經移植）、陰性對照（如不進行神經缺損的修復）及其他實驗組（如合成導管等）；重視動物實驗的質量以及數據的完整性等。同時，為了最大程度地增加干細胞應用于臨床的安全性，今后還需要在干細胞應用的安全性及副作用方面加以探索。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。