腎素-血管緊張素系統拮抗劑對慢性腦缺血大鼠神經血管單元的影響

陳亞雪 李國春 張紅 尹加珍 黃新武

(西南醫科大學 1藥學院，四川 瀘州 646000；2附屬中醫院)

腦血管意外中缺血性腦損傷約占87%〔1～3〕，是致殘率最高的疾病。目前，治療腦卒中多采用溶栓和單純神經細胞保護的方法，用藥時間窗狹窄〔4〕，加上血液再灌注帶來的損傷，對神經細胞功能的保護療效有限。自2002年由美國神經疾病與腦卒中研究所提出神經血管單元(NVU)概念以來〔5〕，人們對NVU這一整體概念越來越重視。對腦的保護也從單一神經保護轉變為對NVU的多種成分的研究。NVU是由神經元-膠質細胞-血管構成，是神經系統結構和功能的基本單位。因此，在腦缺血發生時，是否能較好地保護屏障系統，調節促進NVU功能結構恢復，成為腦缺血發生后保護大腦的重要機制，也成為腦缺血發生后治療的新靶點。研究表明，腦內有獨立的腎素-血管緊張素系統(RAS)，并且高血壓能夠促進炎性反應和炎性細胞的浸潤，加重缺血再灌注后腦損害，而腦缺血再灌注損傷時炎性反應又促進了缺血性腦病的繼發性腦損害，因此，抗高血壓藥物干預治療及腦缺血性再灌注損傷時腦保護一直是臨床關注的重點課題〔6〕。RAS拮抗劑是治療高血壓的常用藥物，先前研究表明該類藥物具有明顯改善腦缺血所致血管性癡呆大鼠學習記憶能力的作用〔7〕。本研究通過RAS拮抗劑對腦缺血大鼠腦組織膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、層黏連蛋白(LN)、水通道蛋白(AQP)4、神經元核抗原(NeuN)表達的影響，進一步探討其對NVU的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠50只，體重(200±10)g，SPF級，由西南醫科大學SPF動物醫學實驗中心提供。

1.2藥物及試劑 藥物：阿利吉侖(武漢三洹醫藥化工有限公司，批號：SH160319)、依那普利(揚子江藥業集團江蘇制藥股份有限公司，批號：16110702)、坎地沙坦(浙江永寧藥業股份有限公司，批號：160601)；試劑：SP免疫組化染色試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司，批號：AG12199372)、LN(北京博奧森生物技術有限公司，批號：AG07254400)、NeuN(abcam公司，批號：GR249899-58)、AQP4(abcam公司，批號：GR84175-12)、GFAP(proteintech公司，catalog number：16825-1-AP)、二氨基聯苯胺(DAB)染色試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司，批號：AG12073405)、免疫染色一抗稀釋液(biooler公司，批號：171105)、凋亡TUNEL試劑盒(美國ROSS公司，批號：0000115114)。

1.3造模、分組與給藥 SD大鼠適應性喂養1 w，隨機分為正常組、模型組、阿利吉侖組、依那普利組、坎地沙坦組各10只。采用不同時點間隔3 d永久性結扎左右側頸總動脈制備慢性腦缺血大鼠模型〔8〕，正常組不結扎血管，模型制作成功后，分別灌胃給藥。用藥量按照人與大鼠每kg體重占體表面積相對比值計算，阿利吉侖30 mg/(kg·d)、依那普利4 mg/(kg·d)、坎地沙坦2 mg/(kg·d)。按照1 ml/100 g灌胃量及用藥量用蒸餾水配制相應濃度的藥物，正常組和模型組給予等量的蒸餾水灌胃，1次/d，持續30 d。

1.4標本采集 用藥結束，大鼠禁食過夜，1%戊巴比妥鈉(0.3 ml/100 g)麻醉，進行心臟灌注固定，剪開大鼠心臟，插入灌注針，先用生理鹽水(加肝素)沖洗至右側心耳流出液無血色，換用4%多聚甲醛灌注固定，直至鼠尾變硬，大鼠耳唇、眼、四肢灰白后，斷頭取腦，放入4%多聚甲醛繼續固定過夜，石蠟包埋切片。

1.5指標檢測方法 按照試劑盒說明書步驟采用SP免疫組化方法分別檢測GFAP、LN、AQP4、NeuN的表達情況。凋亡染色按照試劑盒說明書步驟進行染色。采用ImageJ圖像分析處理軟件，選取典型著色區域，測量積分光密度(IOD)，取平均值。

1.6統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組GFAP及AQP4水平 光鏡下觀察，免疫組化染色陽性GFAP呈棕黃色，放射狀；AQP4呈血管狀棕黃色。與正常組相比，模型組腦組織GFAP、AQP4免疫陽性蛋白數明顯減少(P<0.05)；與模型組相比，阿利吉侖、依那普利及坎地沙坦組GFAP、AQP4明顯增加(P<0.05)。見表1和圖1。

2.2各組LN及NeuN水平 光鏡下觀察，免疫組化染色陽性LN呈棕色顆粒。與正常組相比，模型組腦組織LN、NeuN免疫陽性蛋白數明顯減少(P<0.05)；與模型組相比，各用藥組LN、NeuN明顯增加(P<0.05)。見表1和圖1。

2.3各組神經元凋亡的影響 正常組腦皮質分布較均勻，核呈圓或橢圓形，棕黃色染色較少；模型組神經細胞分布密度降低，胞核變形，藍染加深，藍染胞核區可見部分棕黃色；各用藥組神經細胞數量也有不同程度減少，胞核變形，核藍染加深，藍染胞核區可見少量棕黃色染色，但與模型組相比，各用藥組神經細胞密度降低程度有明顯減輕，凋亡染色減少。經ImageJ圖像分析處理軟件選取典型陽性著色區域，測定選定區域IOD；與正常組比較，模型組IOD均顯著增強(P<0.05)；與模型組比較，各用藥組IOD顯著減弱(P<0.05)，見表1和圖2。

表1 各組腦組織GFAP、AQP4、LN、NeuN、染色及腦皮質神經元凋亡的

與模型組比較：1)P<0.05

圖1 各組腦組織GFAP、AQP4、腦皮質LN和NeuN表達和神經元凋亡(免疫組化，×400)

圖2 各組腦皮質神經元凋亡(HE，×400)

3 討 論

研究表明，腦缺血后能激活腦RAS，可通過復雜的內分泌機制，直接或間接誘導腦血管內皮釋放內皮素〔9〕，加重中樞血流的減少。由于腦供血不足，引起交感神經興奮，激活外周RAS，導致血管外周阻力增加，可致腦供血進一步減少〔10〕。腦缺血后炎性改變也是加重腦缺血損傷的重要機制，最終引起神經損傷導致腦功能障礙。

GFAP是星形膠質細胞的特異性蛋白，作為其特異性標志物可反映星形膠質細胞含量高低。并且起著營養、支持、保護神經元及維持神經元的細胞代謝、離子濃度、水平衡等方面的重要作用。LN是構成基底膜的重要成分，起黏附作用，調控細胞的生長、遷移和黏附能力，同時作為神經突起促進因子，營養神經、促進神經元存活、增生和神經突起的生長。AQP4主要分布于中樞神經系統，其上調易化水分子從腦實質向血管內轉運，促進水腫消退〔11〕。同時，研究發現，AQP4與血腦屏障(BBB)關系密切，神經星形膠質細胞足突參與了BBB的構成，其末梢于毛細血管周圍形成膠質界膜，此界膜占毛細血管表面積的85%～99%，AQP4則密集分布于膠質細胞足突上。NeuN為表達在神經系統大多數神經元胞核和胞質中的特異性蛋白質，是神經元的特異性標記物。因此，這幾個物質被認為是研究NVU的重要指標，能很好地反映NVU保護改善情況。

本實驗表明，腦缺血發生后阿利吉侖組、依那普利組、坦地沙坦從不同環節拮抗RAS的活性，已有研究報道，腎素抑制劑阿利吉侖能夠降低還原型輔酶Ⅱ的氧化酶活性，減輕氧化應激，減輕腦組織損傷〔12〕。血管緊張素轉化酶抑制劑能夠升高腦海馬和皮質三磷酸腺苷水平，增強線粒體的穩定性，減少活性氧簇產生，保護腦組織〔13，14〕。坎地沙坦則為選擇性血管緊張素Ⅱ受體(AT1)拮抗劑，通過與血管平滑肌AT1受體結合而發揮拮抗血管緊張素Ⅱ的作用。本實驗發現，RAS拮抗劑分別從不同環節拮抗RAS作用，是機體對缺血損傷自動修復的表現。