中國藥典中5種標準菌生長曲線的測定

姜興粲，李冰，王瑋瑋，張繼瑜

(中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所 農業農村部獸用藥物創制重點實驗室 甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

細菌的生長曲線反映了細菌在培養過程中生長、繁殖和衰亡的規律，在適宜條件下培養，會出現延遲期、對數生長期、穩定期和衰退期4個階段。本文采用光電比濁法和活菌計數法測定菌株的生長曲線，了解其生長特性與差異。一般情況下，微生物實驗操作步驟繁多，實驗條件嚴苛，本研究在實驗過程中發現了一些問題，獲得了豐富的經驗并總結了若干條注意事項，期望為以后的研究工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌(Bacillus)[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]菌種均來自中國食品藥品檢定研究院。

1.1.2 儀器及試劑

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺、隔水式恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)、恒溫振蕩器、數控超聲波清洗器、電熱恒溫鼓風干燥箱、LDZM-60KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器、優普超純水制造系統、細菌/細胞密度計、比色杯(光徑為10 mm)、sartoriusBSA423S-CW天平、燒杯、試管、三角瓶等。胰酪大豆胨瓊脂培養基(產品批號1073191)、胰酪大豆胨液體培養基(產品批號1073051)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(產品批號1072401)、沙氏葡萄糖液體培養基(產品批號1073051)均購自廣東環凱微生物科技有限公司；0.9%無菌氯化鈉溶液(產品批號L2018041910)。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養與活化

參照《中國獸藥典》(2015年版)的方法進行。把標準菌株大腸埃希菌CMCC(B)44102，金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003，銅綠假單胞菌CMCC(B)10104接種在胰酪大豆胨液體培養基中，35 ℃ 220 r·min-1振蕩培養。白色念珠菌CMCC(F)98001接種在沙氏葡萄糖液體培養基中，25 ℃ 220 r·min-1振蕩培養。傳代培養至第2代，把菌株培養到第3代后即復蘇完成。在培養第3代菌株時，先把第2代菌株的菌懸液稀釋后接種到固體平皿培養基上，以便于挑取單個菌落。黑曲霉CMCC(F)98003為產孢子繁殖的真菌，在沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基中培養至第3代，即完成活化[1-3]。

1.2.2 光電比濁法

分別挑取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的單個菌落接種于胰酪大豆胨液體培養基中，挑取白色念珠菌的單個菌落接種于沙氏葡萄糖液體培養基中。按1.2.1節的條件培養以上菌種，在不同的時間點測定菌懸液在600 nm的吸光度D600，同時用0.9% NaCl稀釋菌懸液至適當的濃度后，按《中國獸藥典》(2015年版)附錄1105平皿法計數并記錄數據。

黑曲霉菌產生豐富的孢子后，由于孢子呈黑色，吸光度過大，首先進行預實驗。查閱資料后，在預實驗中選取D600為1.0時的菌懸液進行實驗并記錄數據[1-2, 4]。

微生物計數儀誤差較大且應用光電比濁計數法時應格外注意比色器皿的透光度，平皿計數時統計3個平皿，取平均值。

1.2.3 標準曲線繪制

分別以時間為橫坐標，菌落形成數量對數值為縱坐標繪制大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉菌和白色念珠菌的生長曲線[2-8]。

2 結果與分析

大腸埃希菌在接種后至1.5 h處于對數生長期，在1.5～4.5 h處于穩定期，在此期間菌落的數量級為108mL-1(圖1中a)。金黃色葡萄球菌在接種后至1.0 h左右時處于對數生長期，在1.0～5.5 h處于穩定期，在此期間菌落的數量級為107mL-1，隨后細菌生長狀態進入衰退期(圖1中b)。銅綠假單胞菌在接種后至2.0 h處于對數生長期，在2.0～7.0 h處于穩定期，在此期間菌落的數量級為108mL-1(圖1中c)。白色念珠菌在接種后至3.0 h處于對數生長期，在3.0～12.0 h處于穩定期，在此期間菌落的數量級為107mL-1(圖1中d)。黑曲霉在接種后至24.0 h處于延遲期，在24.0～96.0 h處于對數生長期，在96.0～110.0 h處于穩定期，在此期間菌落的數量級為108mL-1，隨后黑曲霉孢子生長狀態進入衰退期(圖1中e)。

圖1 大腸埃希菌(a)、金黃色葡萄球菌(b)、銅綠假單胞菌(c)、白色念珠菌(d)和黑曲霉(e)的生長曲線

綜上可知，標準菌株大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌在《中國獸藥典》(2015年版)規定的培養條件下進行培養測定時，4種菌株的生長趨勢相近，金黃色葡萄球菌的生長速率最快，白色念珠菌的生長速率最慢。從趨勢上來看，細菌的生長速率高于真菌的生長速率。實驗中，對黑曲霉菌的預實驗結果進行了二次驗證，2次的結果十分相近，即D600為1.0時，數量級均為107mL-1，符合《中國獸藥典》(2015年版)供試品中接種量的要求，故在完成預實驗后即可開始正式實驗。此次實驗中采用加大接種量的方式，來減少實驗過程中所需要的時間。對產生孢子或有色物質的微生物采用平板菌落計數法測定生長曲線，例如對黑曲霉菌的測定。一般的菌種生長曲線為“S”型，生長初期與后期的菌株活力較弱，實驗中選擇處于對數期即以指數倍增期的“種苗菌”為傳代菌源，所以接種開始其生長曲線即為對數生長期，沒有延遲期。

3 小結

參照《中國獸藥典》(2015年版)的方法，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉5個標準菌種進行了生長曲線的測定。實驗結果表明，大腸埃希菌在1.5～4.5 h處于穩定期，金黃色葡萄球菌在1.0～5.5 h處于穩定期，銅綠假單胞菌在2.0～7.0 h處于穩定期，白色念珠菌在3.0～12.0 h處于穩定期，黑曲霉菌在96.0～110.0 h處于穩定期。多種標準菌株穩定期的測定完成，對相關微生物實驗的進行具有重要的參考意義，對食品工業、生物工程、衛生醫藥和環境保護等多個領域具有參考和利用價值。