高壓均質對大豆分離蛋白乳液流變學特性和 氧化穩定性的影響

劉競男，徐曄曄，王一賀，孫洪蕊，王喜波,，江連洲

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.吉林省農業科學院，吉林 長春 130000）

許多食品屬于水包油（O/W）型乳液體系，如牛奶、飲料、調味醬和調味品等，是熱力學不穩定體系，經常出現聚結、絮凝和脂質氧化等問題[1]。氧化會影響以乳狀液形式存在的食品穩定性[2]，導致感官品質劣變[3]，出現如氣味難聞、營養素降解和色澤變化等現象[4]。

高壓處理可以改變大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）的天然構象，影響其諸多功能特性[5]。Wang Xiansheng等[6]研究發現，高壓處理會使球蛋白的結構展開，同時伴隨著亞基的解離與重聚，顯著改善球蛋白的溶解性、乳化性等特性。高壓均質技術可以提高食品加工的效率[7]，還能顯著提高乳液體系的物理和微生物穩定性[8]，有利于乳液食品的貯存。

乳液流變學特性與其內部體系緊密相關，乳液的流變行為也能夠反映乳液穩定性[9]。目前關于SPI乳液流變學特性的研究和報道越來越多，Rosech等[10]研究通過高壓均質處理的大豆濃縮蛋白乳液流變學特性，發現乳液能夠形成凝膠網絡結構，且穩定性增強。Liu Fu等[11]研究發現，超高壓處理SPI乳液可以通過增加乳化能量輸入，促進凝膠網絡結構的形成。目前提高SPI氧化穩定性主要是通過添加抗氧化劑、表面活性劑等方式，李秋慧等[12]采用酶法改性磷脂，通過添加適量的改性磷脂提高大豆蛋白的氧化穩定性。關于高壓均質對SPI氧化穩定性的影響研究較少，Fernández-ávila等[13]研究發現，經過超高壓（100～300 MPa）處理大豆蛋白乳液，300 MPa處理后的乳液氧化穩定性下降，脂質氧化乳劑強烈依賴于油滴中油相的體積分數和蛋白質附著。本實驗主要研究了不同均質次數對SPI乳液體系平均粒徑、乳析指數、界面蛋白吸附量、流變學特性以及氧化穩定性的影響，并通過光學顯微鏡對SPI乳液進行觀察，以期為高穩定型乳液食品的實際生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆由東北農業大學大豆研究所提供；大豆油 九三糧油工業集團有限公司；三氯乙酸 永華精細化學品有限公司；十二烷基硫酸鈉、Tris 美國Sigma公司；四乙氧基丙烷 天津市光復精細化工研究所；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

T18 Basic型高速分散機/勻漿機 德國IKA公司；LD4-2A型低速離心機 北京醫用離心機廠；AVP-2000型高壓均質機 英國Stansted Fluid Power公司；Mastersizer 2000型激光粒度分析儀、Bohlin Gemini 2型旋轉流變儀 英國Malvern公司；ALPHA1-4 LSC型冷凍干燥機 德國Christ公司；YS100型生物顯微鏡 日本Nikon 公司；HYP-314型消化爐、KDN-102C型定氮儀 上海纖檢儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

根據Sorgentini等[14]方法制備SPI。大豆粉碎并過60 目篩，用索氏提取器經過乙醚提取后獲得脫脂豆粕。再將脫脂豆粕與蒸餾水以體積比1∶10混合。用2 mol/L NaOH溶液調至pH 8.5，室溫攪拌2 h。4 000hg離心2 min，取上清液，用2 mol/L HCl溶液調至pH 4.5，將樣品置于4 ℃條件下靜置過夜，4 000hg離心5 min，將獲得的沉淀物水洗兩次，復溶后調至pH 7.0，倒平板， －18 ℃預凍后進行冷凍干燥。

1.3.2 乳液的制備

將SPI溶于0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），配制質量濃度為5 mg/mL的蛋白溶液，加入疊氮化鈉 （0.02 g/mL），室溫攪拌2 h，水化過夜。加入體積分數為20%大豆油，使用分散機處理1 min，轉速為 10 800 r/min，得到初乳液。然后以120 MPa均質壓力處理，均質循環次數分別為0（未處理）、1、2、3、4 次，每次5 s。分別貯藏0、2、4、6、8、12 d。

1.3.3 粒徑測定

將處理后的SPI樣品分別用去離子水稀釋至質量濃度1 mg/mL，在粒度測定儀上進行測定，參數設置為：顆粒折射率（1.460），分散劑折射率（1.330）。

1.3.4 乳析指數的測定

參照Firebaugh等[15]的方法稍作修改，測定乳液的乳析指數。取10 mL乳液置于玻璃管中（高度12 cm、直徑1.5 cm），密閉保存。室溫貯藏10 d，觀察乳液的狀態，上層為乳析層，下層為清液層。乳析指數計算公式 如式（1）所示。

式中：Hs為下層清液高度/cm；Ht為整個乳液的 高度/cm。

1.3.5 光學顯微鏡觀察

將不同高壓均質次數處理后的乳液振蕩混合均勻，取少量新鮮乳液置于載玻片的中心，蓋上蓋玻片，將其置于光學顯微鏡的觀察區，將放大倍數調整為100 倍，觀察乳液的微觀結構。

1.3.6 界面蛋白吸附量的測定

根據Desrumaux等[16]的方法略作改動，取50 mL待測乳液于離心管中，室溫下離心（15 000hg、45 min），用注射器小心吸取底部清液于另一離心管中，再次離心（15 000hg、45 min），收集下層清液，用凱氏定氮法測定清液中的蛋白含量Ci（CNh 6.25），界面蛋白吸附量（C）的計算公式如式（2）所示。

式中：C0為初始乳液中蛋白的含量/（mg/mL）；Ci為乳狀液中未吸附蛋白的含量/（mg/mL）。

1.3.7 表觀黏度的測定

取樣品于旋轉流變儀感應板上，平板直徑為40 mm，間距為15 mm，剪切速率0.01～100 s－1，選取30 個取樣點，溫度為25 ℃，平衡時間為1 min。測試前需將待測樣品置于室溫下放置30 min，取2 mL乳液于平板間隙并在樣品四周覆蓋硅油。

1.3.8G’和G”的測定

取樣品于旋轉流變儀感應板上，平板直徑為40 mm，檢測間隙為15 mm，在應變力為0.5%的條件下進行頻率掃描，頻率范圍為0.1～10 Hz，測定溫度為25 ℃，以角頻率為橫坐標，彈性模量（G’）和黏性模量（G”）為縱坐標，繪制曲線。

1.3.9 氧化穩定性的測定

1.3.9.1 初級氧化產物

氫過氧化物值的測定參考Shao Yun等[17]的方法并稍加修改，將添加0.02 g/mL疊氮化鈉的乳液分裝在密封玻璃試管中，于50 ℃烘箱中加速氧化。隔天取出，進行氫過氧化物值的測定。具體方法為：將異辛烷和異丙醇按照體積比3∶1混合，即為溶劑1。將甲醇和丁醇按照體積比2∶1混合，即為溶劑2。取0.2 mL樣品，加入1.5 mL溶劑1。充分振搖，3 400hg離心2 min，吸取200 μL上層有機相，加入2.8 mL溶劑2混勻。加入0.3 g/mL硫氰酸銨和亞鐵離子溶液（0.264 moL/L氯化鋇和0.288 mol/L硫酸亞鐵混合后離心）各15 μL，室溫靜置20 min，于510 nm波長處測吸光度。用過氧化氫作標準曲線并計算樣品中的氫過氧化物值。

1.3.9.2 次級氧化產物

硫代巴比妥酸反應產物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值的測定參考S?rensen等[18]的方法，取3 mL乳液于試管中，加入6 mL三氯乙酸試劑（7.5 g/mL）混合并漩渦混勻，將得到的混合物用1 μm微孔濾膜過濾，取2 mL濾液置于含有硫代巴比妥酸試劑（0.8 g/mL）的試管中，混合均勻。將混合物95 ℃水浴15 min處理，然后立即在冰水浴中冷卻，在532 nm波長處記錄最終提取物的吸光度。乳液中TBARS值通過1,1,3,3-四乙氧基丙烷標準曲線進行計算。

1.4 數據統計與分析

所有的實驗重復3 次，結果用平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0軟件對實驗數據進行方差分析 （P＜0.05）；采用Origin 9軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 高壓均質對SPI乳液粒徑的影響

圖 1 均質次數對SPI乳液平均粒徑的影響Fig. 1 Effect of homogenization cycles on average particle size of SPI-stabilized emulsion

高壓均質處理對SPI乳液平均粒徑的影響如圖1所示，不同均質次數處理后樣品的平均粒徑均低于未處理樣品。隨著均質次數的增加，體積平均粒徑先減小后緩慢增加。在均質3 次時，乳液體系平均粒徑達到最小值（0.73 μm），說明高壓均質處理會導致SPI乳液粒徑降低，隨著均質次數的增加效果更好。增加均質次數即增加了輸入能量，Lizarraga等[19]發現，增加輸入能量，乳狀液粒徑分布向低粒徑趨勢轉移，即乳滴粒徑減小。均質4 次時，乳滴粒徑增大，可能是乳液發生“過處理” 現象[20]，由于高壓處理使乳滴粒徑過小，顆粒之間布朗運動速率加快，增加了相互碰撞的次數，從而破壞界面膜，導致蛋白質聚集；同時，高壓均質作用也會引起蛋白變性[16]，蛋白相互作用導致聚集，從而使溶解度下降，蛋白從界面脫落，阻礙了均質對液滴的破壞，減弱了均質的效果[21]。

2.2 SPI乳液的微觀結構

不同均質次數處理的SPI乳液顯微結構如圖2所示，乳滴以絮凝的形式存在，未經處理的乳液油滴數目多，且大小不均一，說明發生了聚結現象，乳液不穩定。經均質處理1～2 次時，仍可見較小尺寸的油滴，但并未有強烈的聚結現象（大尺寸油滴）。在均質3～4 次時均未出現油滴，乳液的粒徑明顯減小，說明高壓均質作用可以阻止聚結現象的發生。

圖 2 不同均質次數處理SPI乳液的光學顯微結構圖Fig. 2 Optical microstructure of SPI-stabilized emulsion subjected to different homogenization cycles

2.3 高壓均質對SPI乳液乳析指數的影響

圖 3 均質次數對SPI乳液的乳析指數的影響Fig. 3 Effect of homogenization cycles on creaming index of SPI-stabilized emulsion

圖3為貯存10 d后不同高壓均質次數處理條件下乳液的乳析指數，未經高壓均質處理的初乳液乳析指數最高，為67.64%；高壓均質處理后的乳液乳析指數較未處理乳液大幅下降，均質3 次和4 次時未發生乳析現象，說明高壓均質處理能夠提高乳液穩定性。Fernández-ávila等[13]也在研究中發現，利用高壓均質技術能生產出物理穩定性較高的SPI乳液。其原因可能是隨著高壓均質次數的增加，蛋白乳液被高壓剪切力切割形成小分子，使蛋白顆粒粒徑減小，更多的蛋白吸附至油-水界面，為液滴間提供足夠的排斥力，從而阻止乳層析的發生，使蛋白乳液的貯存穩定性增強。Li Jinlong等[22]研究指出，乳液粒徑減小、比表面積增加，液滴之間的摩擦力增加，乳液的黏度增大，使乳液聚合速率減緩，從而提高乳液穩定性。這也解釋了隨均質次數的增加乳液表觀黏度增加這一變化趨勢產生的原因。

2.4 高壓均質對SPI乳液界面蛋白吸附量的影響

界面的蛋白含量對乳狀液的穩定性有重要影響[23]。界面蛋白吸附量越高，蛋白吸附至水-油界面的能力越強。均質次數對SPI乳液界面蛋白吸附量影響結果如圖4所示，高壓均質處理1～4 次后，其界面蛋白吸附量分別為93.32%、94.14%、95.63%、94.31%，顯著高于未經處理的乳液（86.73%）。高壓均質處理能夠提高蛋白的柔性結構[24]，使蛋白空間結構展開，更多的疏水基團暴露，促使更多的蛋白吸附到油-水界面，并在乳液界面形成蛋白膜，故高壓均質處理可以提高界面蛋白吸附量[25]。界面蛋白吸附量隨著均質次數的增加而先增加后降低，均質4 次時略有降低，可能是因為界面膜已經達到蛋白的最大吸附量。當界面蛋白吸附量達到一定值時，蛋白之間的相互作用反而抑制連續相中蛋白的進一步吸附[26]。

圖 4 均質次數對SPI乳液界面蛋白吸附量的影響Fig. 4 Effect of homogenization cycles on interfacial protein adsorption of SPI-stabilized emulsion

2.5 高壓均質對SPI乳液表觀黏度的影響

圖 5 不同均質次數SPI乳液的表觀黏度隨剪切速率的變化Fig. 5 Apparent viscosity versus shear rate curves of emulsion subjected to different homogenization cycles

根據Stoke定律，當乳液體系黏度較大時，液滴的上浮速率減緩，有利于乳液保持更好的穩定性[27]。由圖5可以看出，經高壓均質處理的乳液表觀黏度隨剪切速率的增加而下降，發生了非牛頓流體的剪切稀化現象[28]。在未受到剪切力時，流體分子間相互纏結在一起；在剪切力的作用下，流體動力將破壞體系中的絮凝物，聚集的脂肪球破碎，液滴定向排布阻力減小，乳液表觀黏度減小。剪切速率增加到一定值后，分子間排列完成，黏度不再變化[29]。

乳液表觀黏度隨均質次數增加呈先升高后降低的趨勢，均質3 次的乳液表觀黏度最大，這與乳析指數的結果一致。隨著均質次數的增加，乳液粒徑減小，分散相中液滴數目增加，兩個液滴進入相互吸引區的機會迅速增加，從而使其位移困難，導致乳液表觀黏度增大。當均質4 次時，乳液表觀黏度反而降低。Perrier-Cornet等[30]的研究表明，蛋白顆粒粒徑較大容易導致蛋白質的聚集，隨著蛋白顆粒粒徑的增大，其聚集更加明顯。這可能是由于隨著均質次數的增多，體系出現了“過處理”效應，部分解離的SPI分子重新聚集，通過新的二硫鍵形成復雜的聚集體[31]，從而使乳液表觀黏度降低。

2.6 高壓均質對SPI乳液剪切流變行為的影響

圖 6 不同均質次數SPI乳液G’和G”隨角頻率的變化Fig. 6 Curves of G’ and G” values versus angle frequency with different homogenization cycles

乳液的流變學性質可以反映乳液分散體系的貯藏穩定性[32]。G’和G”的變化趨勢如圖6所示，未處理的乳液G’和G”很小，接近0 Pa。但經高壓均質處理后，乳液G’和G”明顯增加，表明高壓均質處理可以提高乳液的G’和G”。處理后乳液的G’都大于相應的G”，表現出明顯的彈性行為，表明以彈性為主的凝膠狀網絡結構形成。隨著均質次數的增加，G’和G”呈先增加后降低的趨勢，當均質3 次時，G’和G”最大。這與乳析指數的結果一致。當均質4 次時，乳液均質發生“過處理”現象，蛋白質相互作用并發生聚集，由于空間位阻作用抑制了后續吸附蛋白質的去折疊，從而使蛋白質分子間的相互作用位點不易接近，減小了G’和G”[33]。高壓均質作用提高了SPI的表面疏水性和柔性[34]，蛋白質通過疏水作用結合，增加了G’[35]。同時，高壓均質作用使乳液粒徑降低，更多的蛋白顆粒吸附到油-水界面上，由于蛋白顆粒對油滴的穩定作用，蛋白形成穩定的網絡結構，從而提高乳液黏度，并增加了乳液的G’，進而增強了乳液穩定性。

2.7 高壓均質對SPI乳液氧化穩定性的影響

圖 7 高壓均質對SPI乳液初級氧化產物的影響Fig. 7 Effect of high pressure homogenization on hydroperoxide value of SPI-stabilized emulsion

圖 8 高壓均質對SPI乳液TBARS值的影響Fig. 8 Effect of high pressure homogenization on TBARS value of SPI-stabilized emulsion

如圖7、8所示，隨著貯存時間的延長，脂肪氧化程度逐漸加深，蛋白乳液的氫過氧化物值增加，體系TBARS值呈現先增加后減少再增加的趨勢。氫過氧化物能夠被分解轉化為次級氧化產物[36]，從而導致TBARS值增加。當貯存4 d時，氧化過程中部分次級氧化產物可能轉化為其他氧化成分[37]，從而使TBARS值下降。在貯存6 d后，TBARS值再次增加，可能是由于氫過氧化物含量增加較快且極易分解，其分解速率大于次級氧化產物的分解速率。

高壓均質處理樣品的氫過氧化物值和TBARS值均低于未處理樣品，在均質3 次時，其氫過氧化物值和TBARS值均最低。這是由于高壓均質處理使蛋白顆粒減小，更多的蛋白吸附至油-水界面并維持乳液穩定，在水相和油相之間形成空間位阻。此外，乳液中的蛋白質吸附在油滴表面后形成一層黏彈性蛋白膜，蛋白膜可以有效阻止脂質氧化的引發劑擴散到油滴內部，同時限制水相中的過渡金屬與油相相互作用，從而起到抑制油脂氧化的作用[17]。Ries[38]和Mei Longyuan[39]等的研究也表明，粒徑較小的乳液在貯藏過程中測得的脂質過氧化物和揮發性脂質氧化產物含量都更少。因此，均質3 次時，乳液體系的氧化穩定性更佳。

3 結 論

隨均質次數的增加，乳液粒徑先減小后增加，乳析指數呈降低趨勢，在均質3 次和4 次時未發生乳析現象，表明乳液體系穩定性更好。根據微觀結構觀察結果，隨著均質次數的增加，油滴尺寸逐漸減小至消失，乳滴粒徑逐漸減小，且分布逐漸均勻，說明高壓均質作用可以阻止聚結現象發生。

隨著均質次數的增加，界面蛋白吸附量、表觀黏度、G’和G”均呈先增加后減小的趨勢，在均質3 次時達到最大，說明此時乳液體系的穩定性最佳。剪切流變學特性實驗結果說明高壓均質處理的乳液具有良好的動力學穩定性。

高壓均質處理的樣品氫過氧化物值和TBARS值均低于未處理樣品，說明高壓均質作用能夠抑制脂肪氧化。隨著貯存時間的延長，乳液體系的氫過氧化物值增加，TBARS值呈現先增加后減少再增加的趨勢。當均質3 次時，乳液體系的氫過氧化物值和TBARS值最低，即氧化穩定性更佳。