低表達衰老標記蛋白30對高鈣狀態下人晶狀體上皮細胞增殖和氧化的影響

李松蔓，韓子豪，Aint Thu Thu Win，陳 曦，梁 皓

0引言

衰老標記蛋白30(senescence marker protein 30，SMP30)，亦稱Regucalcin(RGN)，是一種與衰老相關的鈣調節蛋白[1]。研究報道，SMP30在白內障患者晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)中的含量高于正常人，但其在60歲以上白內障患者中的含量低于60歲及以下患者[2]，而SMP30下調導致人LECs衰老及凋亡程度加劇[3-4]，提示SMP30含量減少可能與白內障形成有關。持續高鈣導致鈣穩態喪失是白內障的關鍵致病因素[5]，然而，SMP30作為一種鈣調節蛋白，其在高鈣/鈣紊亂狀態下對人LECs影響的文獻報道較少。本研究通過體外構建高鈣培養狀態，模擬發生白內障時人LECs的病理狀態，同時合成人SMP30靶向基因RGN的RNA干擾(RNA interference，RNAi)序列，下調SMP30在人LECs系SRA01/04中的表達，研究細胞增殖、氧化指標的改變，探討SMP30在白內障形成中的作用。

1材料和方法

1.1材料人LECs系SRA01/04(廣州吉妮歐生物科技公司)，慢病毒包裝細胞人腎上皮細胞系293T、病毒包裝輔助質粒pHelper1.0質粒、pHelper2.0質粒(上海吉凱基因化學技術有限公司)；RPMI 1640培養基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(美國Gibco公司)，青霉素、鏈霉素(美國Sigma公司),磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS，北京索萊寶科技有限公司)，總RNA提取試劑盒(美國Axyen公司),逆轉錄試劑盒(Takara公司，RR047A)，BrdU-Elisa試劑盒(瑞士Roche公司)，總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(WST-1法)、氧化型谷胱甘肽/總谷胱甘肽(oxidized glutathione/total glutathione，GSSG/T-GSH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；細胞培養超凈臺(新加坡藝思高科技有限公司)，二氧化碳恒溫培養箱(美國Thermo Scientific公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，Real time PCR儀器(Agilent公司)，酶標儀(瑞士Tecan公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養SRA01/04細胞用含體積分數10%的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素(pH 7.4)的RPMI 1640培養基培養，并置于環境為37℃、含體積分數5% CO2和95%空氣的細胞培養箱中培養。

1.2.2構建RGN-RNAi慢病毒表達載體

1.2.2.1設計并合成short hairpin RNA(shRNA)引物根據NCBI Genebank中人RGN基因(NM_152869.3)mRNA序列，遵循RNAi序列設計原則，設計3條RNAi靶點序列用于干擾SMP30靶向基因RGN的表達，同時以Scramble序列作為陰性對照，BLAST分析排除其他非特異同源性序列。實驗分組如下：實驗組(RGN表達干擾組1～3，knock down group 1～3，KD1～3)，陰性對照組(空載體組，negative control group of knock down，NCKD)，空白對照組(SRA01/04細胞組，blank control group，CON)。3條RNAi靶點序列分別為：KD1(RGN-RNAi-1)：ACCTGAAGCTGGTGGAATT；KD2(RGN-RNAi-2)：TGTGAAGTTGCCTGTTGAT；KD3(RGN-RNAi-3)：ACCGCAGAAGTGTTTACAA。Scramble序列(NCKD)為：TTCTCCGAACGTGTCACGT。將上述4段序列分別設計合成shRNA寡核苷酸單鏈，每對由正義鏈和反義鏈組成(表1)，在5’和3’端分別加入Age Ⅰ和EcoRⅠ酶切位點，在退火后形成含短發夾結構的小片段雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)。

1.2.2.2 RGN-RNAi慢病毒載體的構建與鑒定通過T4 DNA連接酶，將Age Ⅰ+EcoR Ⅰ雙酶切線性化成功的慢病毒載體GV248(框架結構：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin)和上述dsDNA混合進行連接反應。隨后將連接好的重組質粒轉化感受態的大腸桿菌，用含氨芐青霉素培養基選擇陽性克隆，對單菌落進行擴增培養，最后進行菌落PCR及DNA測序鑒定，驗證重組克隆中插入片段序列是否與設計的目標序列一致。其中，通用引物為：上游5’-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3’，下游5’-ATGTCCTTCTGCTGATACTGGG-3’。

1.2.2.3 RGN-RNAi慢病毒顆粒的包裝與質檢選擇測序正確的菌液轉接于10mL的LB液體培養基中，37℃培養24h，通過天根無內毒素質粒小提中量試劑盒抽提合格的質粒。取對數生長期的慢病毒包裝細胞293T細胞接種于10cm細胞培養皿中(細胞密度：5×106個/15mL)，置于細胞培養箱中培養約24h，待細胞密度達70%～80%時用于感染。感染前用無血清的培養基培養293T細胞2h。將提取合格的GV248載體質粒20μg、pHelper1.0質粒15μg、pHelper2.0質粒10μg及相應體積的吉凱感染試劑均勻混合，調整使混合液總體積為1mL，室溫孵育15min。將混合液緩慢滴入293T細胞培養液中，輕混勻避免將細胞吹起，置于細胞培養箱培養。6h后移除含感染混合液的培養基，用10mL PBS輕洗培養皿一次，緩慢加入20mL含體積分數為10%胎牛血清的培養基。繼續培養細胞48～72h后收集293T細胞上清液，4℃、4 000g離心10min，0.45μm濾器過濾、收集上清液，再次4℃、8 000g離心2h，移除液體并保留沉淀，加入吉凱病毒保存液重懸充分溶解沉淀，4 000g高速離心5min，按要求分裝上清。最后對慢病毒進行質檢和病毒滴度檢測。

1.2.3 RGN-RNAi慢病毒感染SRA01/04細胞

1.2.3.1慢病毒感染細胞的預實驗用完全培養基制備密度為2×103個/每孔的SRA01/04細胞懸液，取100μL/孔加入96孔板，繼續培養24h。分別制備含50μg/mL Polybrene(助感染劑)的完全培養基[P(M)]；含50μg/mL Polybrene的感染增強劑(enhanced infection solution，Eni.S.)[P(E)]，各200μL；用Eni.S.將病毒稀釋成三種滴度：1×108、1×107、1×106TU/mL，各50μL。在每孔細胞融合度為20%～30%時，根據表2分別更換培養液和加入病毒液進行細胞感染：A組：常規培養基+病毒；B組：常規培養基+病毒+ P(M)；C組：Eni.S.+病毒；D組：Eni.S.+P(E)+病毒。混勻后繼續培養8～12h，觀察細胞形態并更換培養基。在感染約3～4d、細胞綠色熒光表達豐度較高、感染效率約80%且細胞狀態良好時，所對應的感染條件及感染復數(multiplicity of infection, MOI)可用于后續正式感染SRA01/04細胞的實驗。由于此慢病毒含有嘌呤霉素抗性基因，故可在感染3～4d后往完全培養基中加入適量嘌呤霉素以篩選目標基因穩定表達的細胞。

表1 針對人RGN基因序列設計的寡核苷酸單鏈

No5 STEMPLOOPSTEMP3 shRNA-KD1-FCcggcaACCTGAAGCTGGTGGAATTCTCGAGAATTCCACCAGCTTCAGGTtgTTTTTgshRNA-KD1-RaattcaaaaacaACCTGAAGCTGGTGGAATTCTCGAGAATTCCACCAGCTTCAGGTtgshRNA-KD2-FCcggacTGTGAAGTTGCCTGTTGATCTCGAGATCAACAGGCAACTTCACAgtTTTTTgshRNA-KD2-RaattcaaaaaacTGTGAAGTTGCCTGTTGATCTCGAGATCAACAGGCAACTTCACAgtshRNA-KD3-FCcggcaACCGCAGAAGTGTTTACAACTCGAGTTGTAAACACTTCTGCGGTtgTTTTTgshRNA-KD3-RaattcaaaaacaACCGCAGAAGTGTTTACAACTCGAGTTGTAAACACTTCTGCGGTtgshRNA-NCKD-FCcggTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTgshRNA-NCKD-RaattcaaaaaTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA

表2 感染預實驗分組和感染條件

組別病毒滴度1×108TU/mL(MOI=100)1×107TU/mL(MOI=10)1×106TU/mL(MOI=1)Control組培養基100μL培養基100μL培養基100μLA組培養基90μL+Virus10μL培養基90μL+Virus10μL培養基90μL+Virus10μLB組培養基80μL+Virus10μL+P(M)10μL培養基80μL+Virus10μL+P(M)10μL培養基80μL+Virus10μL+P(M)10μLC組Eni.S.90μL+Virus10μLEni.S.90μL+Virus10μLEni.S.90μL+Virus10μLD組Eni.S.80μL+Virus10μL+P(E)10μLEni.S.80μL+Virus10μL+P(E)10μLEni.S.80μL+Virus10μL+P(E)10μL

1.2.3.2 RT-PCR篩選干擾效果佳的RGN-RNAi慢病毒載體選取各組適量感染成功的細胞，常規消化、離心收集細胞沉淀，通過總RNA提取試劑盒收集細胞內RNA，用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，最后用Real time PCR 儀器檢測各組感染SRA01/04細胞中相對RGN mRNA的表達情況。內參基因和目的基因引物由吉凱基因設計合成，RGN-F：5’-GGTCGCTAGACCACAAAATCT-3’，RGN-R：5’-CTAAACGAATCACTCTTCCTCC-3’，擴增片段大小為210bp；內參基因引物為GAPDH-F：5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，GAPDH-R：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’，擴增片段大小為121bp。反應體系為20μL。反應參數：95℃預變性30s，95℃變性15s，60℃復性延伸30s，進行40次循環；熔解曲線為95℃ 5s，60℃ 60s，95℃ 5s continuous，最后50℃ 30s結束反應。采用2-△△Ct法計算基因表達的相對比值。

1.2.4 RGN-RNAi對高鈣狀態下細胞增殖和氧化應激的影響

1.2.4.1構建SRA01/04細胞高鈣培養狀態參考課題組前期研究結果[6]，用含15mmol/L CaCl2的完全培養基處理SRA01/04細胞24h模擬白內障形成時細胞外高鈣/鈣紊亂的病理狀態。在后續實驗中，將選用RGN-RNAi干擾效果最佳的實驗組、NCKD組及CON組在此狀態培養后，進行細胞增殖活力和氧化指標的檢測。

1.2.4.2 BrdU-Elisa法檢測高鈣狀態下的細胞增殖活力按細胞量2×103個/孔均勻接種于96孔板，在高鈣培養狀態下，于細胞貼壁后第1、4d檢測細胞增殖活力。參照BrdU-Elisa試劑盒操作說明，用培養基以1∶100稀釋BrdU原液，在檢測前每孔加入10μL稀釋后的BrdU試劑，作用8h。吸棄上述液體，室溫避光，分別加入FixDenat試劑(200μL/孔)和10% BSA(200μL/孔)進行固定及封閉各30min；用Anti-BrdU-POD工作液(200μL/孔)孵育90min。用無菌雙蒸水按1∶10稀釋washing Buffer，每孔加入200～300μL，洗板3次，待干。隨后在空的細胞板外盒中加入無菌雙蒸水，將待測培養板放入其中，無菌雙蒸水沒過培養孔，待干。室溫避光，加入substrate solution(100μL/孔)作用5～30min，待液體變成藍色，加入10% H2SO4(50μL/孔)，使用酶標儀檢測單波長為450nm時的OD值。

1.2.4.3高鈣狀態下細胞氧化指標的檢測檢測細胞內SOD活性及GSSG/T-GSH水平以反映細胞抗氧化及氧化水平的變化。SOD活性用總SOD測定試劑盒(WST-1法)檢測，細胞常規消化、離心收集細胞沉淀，用500μL PBS輕洗細胞2次，離心收集細胞沉淀，加入500μL PBS輕吹勻，在冰水浴下超聲碎解細胞，將該原液稀釋成梯度濃度樣本待用，用酶標儀讀取測定OD450nm，核酸微量檢測儀測定樣本蛋白濃度，計算SOD活力。GSSG/T-GSH水平用GSSG/T-GSH試劑盒檢測，細胞處理步驟同前，加入500μL試劑4(試劑盒自帶)混勻后在冰水浴下超聲碎解細胞，酶標儀測出OD450nm數值，計算GSSG/T-GSH比值。

圖1RGN-RNAi載體陽性克隆的PCR鑒定A：RGN-RNAi-1；B：RGN-RAi-2；C：RGN-RNAi-3。1：以ddH2O為空白對照模板，擬鑒定體系無污染；2：以未插入靶向基因的空載體為陰性對照模板，擬證明擴增過程無假陽性現象；3：Marker；4～8：RGN-RNAi轉化子鑒定。

圖2RGN-RNAi重組質粒測序結果A：RGN-RNAi-1；B：RGN-RNAi-2；C：RGN-RNAi-3。

2結果

2.1 RGN-RNAi慢病毒載體的鑒定菌落PCR鑒定結果顯示，連接入shRNA片段的陽性克隆片段大小為542bp，沒有連接入shRNA片段的空載體克隆片段大小為508bp，結合PCR電泳圖初步證實陽性克隆的目的基因片段已正確插入GV248慢病毒載體(圖1)。選取連接成功的克隆進行測序分析，結果提示3組慢病毒載體均有已設計的目的基因片段，其序列和設計的人RGN寡核苷酸序列完全相同(圖2)，再次證實目的基因片段已插入GV248載體中，重組RGN-RNAi慢病毒載體構建成功。

2.2 RGN-RNAi慢病毒包裝與滴度測定本研究所使用的GV248慢病毒載體攜帶增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein，eGFP)基因，是一種廣泛用于細胞內靶蛋白分子定位和功能觀察的報告基因，故可通過觀察細胞內GFP的表達情況分析感染結果。將攜帶靶向基因的GV248載體質粒、病毒包裝輔助質粒(pHelper1.0載體質粒+pHelper2.0載體質粒)同時感染293T細胞，收集、濃縮、純化病毒。用熒光法測定滴度，取10μL濃縮后的病毒采用10倍梯度稀釋后感染293T細胞，根據稀釋倍數及GFP的表達情況，可見熒光細胞數隨稀釋倍數的增加而減少，RGN-RNAi-1、RGN-RNAi-2、RGN-RNAi-3三種慢病毒的滴度分別為8×108、1×109、1×109TU/mL，提示均有大量質粒轉入293T細胞，病毒包裝成功(圖3)。

2.3 RGN-RNAi慢病毒感染SRA01/04細胞預實驗結果表明，細胞貼壁率達到約20%時，以MOI=5為基礎，配置含適量的慢病毒及5μg/mL助感染試劑的完全培養基，培養細胞約16h后更換為普通完全培養基，約72h后熒光顯微鏡觀察可見感染細胞有GFP表達，感染效率接近80%，且細胞生長狀態良好，感染細胞多次傳代形態均一且性狀穩定，提示細胞感染成功。后續實驗以細胞5×104個/孔均勻接種于6孔板進行正式感染，用于增加每次感染細胞的數量，接種體積為2mL/孔，換液體積為1mL/次(圖4)。

2.4 RGN-RNAi對SRA01/04細胞RGN基因表達的影響RGN-RNAi慢病毒以優化條件感染SRA01/04細胞后，收集RNA樣品，應用Real time PCR檢測SMP30靶向基因RGN mRNA表達水平的變化，結果顯示，CON組、NCKD組、實驗組(KD1～3)細胞RGN mRNA相對表達量分別為0.95±0.08、1.00±0.03、0.07±0.01、0.40±0.06、0.26±0.04，差異有統計學意義(F=191.734，P<0.001；n=3)；CON組和NCKD組細胞RGN mRNA的表達水平差異無統計學意義(P=0.26)，提示慢病毒空載質粒感染對SMP30靶向基因RGN的表達無特異性的影響；與NCKD組相比，實驗組(KD1～3)細胞RGN mRNA水平均有不同程度降低(均P<0.001)，實驗組(KD1～3)的敲減效率分別為93%、60%、74%，故選擇干擾效果最佳的KD1組shRNA片段進行后續實驗。

圖3RGN-RNAi慢病毒感染293T細胞后的滴度測定熒光圖(×100)A：1μL病毒原液；B：0.1μL病毒原液；C：0.01μL病毒原液；D：0.001μL病毒原液。

圖4RGN-RNAi慢病毒感染SRA01/04細胞(×100)A：光學顯微鏡下觀察；B：熒光顯微鏡下觀察。

2.5 RGN-RNAi對高鈣狀態下SRA01/04細胞增殖的影響本研究以第4d與第1d OD450nm的比值(ODday4/ODday1)表示各組細胞的相對增殖活力。Brdu-Elisa檢測結果顯示，高鈣狀態下，CON組、NCKD組、實驗組(KD1)細胞相對增殖活力分別為2.96±0.25、2.95±0.08、2.42±0.08，差異有統計學意義(F=11.37，P=0.01；n=3)；實驗組(KD1)細胞相對增殖活力低于CON組和NCKD組(均P=0.01)，但CON組和NCKD組之間差異無統計學意義(P=0.97)。

2.6 RGN-RNAi對高鈣狀態下SRA01/04細胞氧化應激的影響SOD活性檢測結果顯示，高鈣狀態下，CON組、NCKD組、實驗組(KD1)細胞SOD活力分別為26.33±1.04、31.10±2.24、11.69±0.52U/mg，差異有統計學意義(F=57.81，P=0.01；n=3)；實驗組(KD1)細胞SOD活力低于CON組和NCKD組(均P<0.001)，但CON組和NCKD組之間差異無統計學意義(P=0.07)。

GSSG/T-GSH水平檢測結果顯示，高鈣狀態下，CON組、NCKD組、實驗組(KD1)細胞GSSG/T-GSH水平分別為20.05±2.45、15.93±3.47、70.80±2.34，差異有統計學意義(F=357.63，P<0.001；n=3)；實驗組(KD1)細胞GSSG/T-GSH水平高于CON組和NCKD組(均P<0.001)，但CON組和NCKD組之間差異無統計學意義(P=0.12)。

3討論

SMP30基因定位于X染色體的11.3～11.23區域，由7個外顯子和6個內含子組成，有研究發現，SMP30與一種編碼Regucalcin蛋白的cDNA相同，兩者均隨機體衰老而逐漸減少，不受性別因素影響，故認為兩者為同一種蛋白，其靶向基因符號為RGN。SMP30每分子蛋白質存在6～7個Ca2+高親和結合位點，其在肝、腎等組織細胞內鈣穩態、細胞增殖、氧化應激、凋亡等方面發揮調控作用，故SMP30是一種具備多重保護作用的鈣結合蛋白及鈣信號轉導蛋白，提示其在機體內的表達水平可能與衰老相關性疾病的分期相關，SMP30或許可作為機體衰老、疾病發生和進展的潛在性標記物[7-10]。

近年研究發現，SMP30與白內障密切相關。在臨床研究中，SMP30在年齡相關性白內障患者晶狀體前囊膜周邊部的LECs表達強，中央部表達弱，SMP30低表達區域出現人LECs衰老及凋亡程度加劇[3-4]。在體外正常培養狀態下，下調SMP30可使人LECs系SRA01/04細胞增殖活性下降、凋亡率增加[11]。動物模型研究，在紫外線B照射誘導下，SMP30基因敲除小鼠由于內源性維生素C生成障礙而較野生型小鼠及維生素C喂養型KO小鼠更易出現晶狀體混濁[12]。提示SMP30可能是LECs內的一種保護性蛋白，其含量下降可能誘導/加速白內障的形成。

RNAi是一種廣泛應用于基因功能研究的基因阻斷技術，構建shRNA載體是目前RNAi最常用的方法之一，慢病毒載體能夠產生表達高滴度shRNA的慢病毒，通過慢病毒載體介導RNAi，即結合慢病毒載體高效、整合的優點與RNAi的特性，可長期、穩定地抑制靶向基因的表達，并傳代到子代細胞中，是構建理想的實驗細胞模型的常見技術，其在白內障基礎研究中的應用也愈加廣泛[13-14]。故本研究以慢病毒為載體，利用shRNA抑制人SMP30靶向基因RGN的表達，最終成功構建干擾SMP30表達效果佳、感染SRA01/04效率高的shRNA慢病毒載體，以SMP30低表達人LECs系SRA01/04細胞為基礎開展系列研究。

關于白內障病因學的基礎研究表明，持續高鈣和氧化損傷狀態是白內障重要的發病因素。既往國內外學者通過含高濃度Ca2+的培養液培養透明晶狀體和LECs發現，晶狀體混濁與體外Ca2+濃度的增加相關，細胞外異常的高鈣濃度可使LECs鈣穩態喪失，最終導致白內障[15-16]。此外，Ca2+超載又可破壞線粒體、內質網等鈣、氧化調節相關細胞器結構，加聚鈣紊亂及氧化應激程度，并形成惡性循環[17-18]。SOD活力和GSSG/T-GSH水平能間接反映細胞抗氧化損傷能力和氧化應激程度。故本研究結合前期研究結果，選用15mmol/L CaCl2配制高鈣培養基，培養SRA01/04細胞24h，通過體外構建高鈣培養狀態，用于模擬白內障形成過程中人LECs出現高鈣/鈣紊亂的病理狀態。我們發現，在高鈣培養狀態下，下調SMP30的表達，可導致SRA01/04細胞增殖活力及抗氧化能力減弱，細胞內氧化應激程度加劇。有文獻報道，SMP30/Regucalcin作為一種鈣調節蛋白，可通過增加細胞肌漿網Ca2+-ATP酶(SERCA)活性、線粒體Ca2+-ATP酶活性和ATP依賴性Ca2+攝取加速肌質網和線粒體中Ca2+的攝取，以維持細胞內鈣穩態和增加細胞存活率的作用[19-21]。由此我們分析，在高鈣誘導細胞損傷的狀態下，SMP30在SRA01/04細胞中可能也具有調節Ca2+信號轉導有關的酶活性、維持細胞鈣穩態的作用，當SMP30含量減少，其對SRA01/04細胞的保護作用減弱，使細胞易處于各種損傷因素所致的Ca2+異常波動的環境，加劇細胞內鈣紊亂及氧化損傷的程度，導致細胞增殖活力下降或細胞死亡，最終誘導白內障的形成或發展。

綜上所述，高鈣培養狀態下，shRNA慢病毒載體介導的SMP30低表達SRA01/04(人LECs)細胞增殖活力及抗氧化應激能力減弱，提示增加細胞外Ca2+濃度模擬人LECs在白內障形成的病理狀態條件，SMP30的存在可能在一定程度上延緩了SRA01/04細胞應激損傷進程，具有調控細胞增殖和抗氧化損傷的保護作用。雖已有研究報道高表達SMP30在人LECs系中具有增加細胞生存率、抗凋亡、抑制活性氧、延緩紫外線損傷等作用[11，22]，但本實驗從另一角度開展低表達SMP30對人LECs作用的初步研究，為未來探索SMP30在人LECs和晶狀體中的作用提供了新的實驗基礎。然而，關于SMP30在人LECs內可能參與鈣調控信號通路的具體機制等內容尚未明確，有待后期進一步研究。