455～470nm波長的面陣藍(lán)光對(duì)SD大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響

李慧麗，陳治威，孫小紅，董國軍，王大洪，肖勝燕，李小丹

0引言

近年來，關(guān)于光對(duì)視網(wǎng)膜的損傷一直是眼科及視光學(xué)專業(yè)研究的熱點(diǎn)問題，藍(lán)光作為高能短波可見光，波長在400～500nm間對(duì)視網(wǎng)膜的影響最大，對(duì)視網(wǎng)膜具有高度的敏感性及穿透力，故又被稱為“高能可見光”[1]，其對(duì)視網(wǎng)膜造成光化學(xué)損害已被研究證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)選取波長為455～470nm的藍(lán)光燈珠制成實(shí)驗(yàn)所需的面陣藍(lán)光發(fā)光器，觀察面陣藍(lán)光對(duì)SD大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響，討論分析照射時(shí)間與視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系。

圖1規(guī)格380mm×325mm×180mm聚乙烯PP飼養(yǎng)籠，頂置藍(lán)光發(fā)光器。

圖2藍(lán)光發(fā)光器內(nèi)側(cè)面。

圖3藍(lán)光發(fā)光器外側(cè)面。

圖4實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。

圖5藍(lán)光照射整體工作狀態(tài)。

圖6正在進(jìn)行藍(lán)光照射的單個(gè)飼養(yǎng)籠。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量400～450g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。SPF級(jí)動(dòng)物包房分籠飼養(yǎng)，12h/12h(明暗交替)室溫18℃～20℃，相對(duì)濕度40%～70%，通風(fēng)換氣8～12次/h。實(shí)驗(yàn)SD大鼠均用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(渝)2012-0006]。對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠行常規(guī)眼部檢查，證實(shí)其外眼和眼底均正常。動(dòng)物管理符合動(dòng)物保護(hù)條例并符合動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。

1.1.2主要試劑及儀器DAB(diaminobenzidine,DAB二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒)(中杉金橋生物科技有限公司)；粘附載玻片(CITOTEST江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器械有限公司)；AR分析純丙酮(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；冰醋酸(臺(tái)山市新寧制藥有限公司)；8%～14%甲醛溶液(重慶川東化工有限公司)；10%的水合氯醛注射液(青島宇龍海藻有限公司)；95%乙醇(四川金山制藥有限公司)；照度計(jì)ZD-10(杭州遠(yuǎn)方光電信息股份有限公司)；重慶康華瑞明科技股份有限公司協(xié)助制作的藍(lán)光發(fā)光器(圖1)。目前藍(lán)光燈珠波長多455～470nm，本實(shí)驗(yàn)我們使用的燈珠波長為455～470nm，主峰462nm(廣東臺(tái)宏光電科技有限公司)。雙目生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；11800型修塊機(jī)(瑞典LKB公司)；8800型超薄切片機(jī)(德國Leica公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組選取6周齡健康SD雄性大鼠24只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=6)和實(shí)驗(yàn)組(n=18)，正常對(duì)照組無任何干預(yù)正常喂養(yǎng)6wk；實(shí)驗(yàn)組分為3個(gè)小組，每天分別予藍(lán)光發(fā)光器(455～470nm、391Lx)照射3、6、12h，連續(xù)照射6wk。

1.2.2藍(lán)光發(fā)光器的制備聚乙烯PP飼養(yǎng)籠，規(guī)格380mm×325mm×180mm，頂蓋安置藍(lán)光發(fā)光器(圖1)。發(fā)光器由9個(gè)大功率藍(lán)光LED燈組成，橫向每組串聯(lián)3個(gè)燈珠，縱向并聯(lián)3組，燈珠之間橫向間距9cm，縱向間距12cm(圖2、3)。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察，發(fā)現(xiàn)藍(lán)光照射下大鼠活動(dòng)范圍主要集中在箱底周邊區(qū)域，實(shí)時(shí)測得距離發(fā)光器光源20cm處實(shí)驗(yàn)箱底四角及四邊中點(diǎn)照度值為385.2～397.5(均值391)Lx，作為本實(shí)驗(yàn)的照度值(圖4～6)。

1.2.3大鼠眼球壁組織病理學(xué)檢查快速頸椎脫臼處死大鼠，分別于大鼠雙眼角膜緣12∶00位縫線做標(biāo)記，立即摘除眼球，眼球取下后立刻投入AR分析純丙酮50mL+冰乙酸2mL+40%甲醛4mL+蒸餾水3mL的混合液中，固定24h，2h后在眼球標(biāo)本側(cè)面角膜緣開窗，便于固定液滲入，眼球標(biāo)本繼續(xù)再固定2d，取出標(biāo)本，再轉(zhuǎn)入80%乙醇浸泡4h，95%乙醇浸泡4h，100%乙醇浸泡4h，脫水固定，二甲苯透明，浸蠟3h，包埋，矢狀面切片，切片厚度4μm，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察455～470nm波長的面陣藍(lán)光對(duì)SD大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響，討論分析照射時(shí)間與視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系。

圖7各組大鼠視網(wǎng)膜組織的組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE×200)A：正常對(duì)照組大鼠眼視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和形態(tài)正常；B：3h實(shí)驗(yàn)組大鼠眼脈絡(luò)膜纖維結(jié)締組織玻璃樣改變(藍(lán)箭頭)，小血管增生(黑箭頭)，色素層變薄，細(xì)胞稀疏(綠箭頭)，視細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)量減少(紅箭頭)；C：6h實(shí)驗(yàn)組大鼠眼脈絡(luò)膜層疏松水腫，小血管增生(黑箭頭)，色素層變薄，細(xì)胞稀疏(綠箭頭)，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層局部胞漿豐富，向內(nèi)側(cè)形成胞突(白箭頭)；D：12h實(shí)驗(yàn)組大鼠眼脈絡(luò)膜層疏松水腫小血管增生(黑箭頭)，色素層變薄(綠箭頭)，視細(xì)胞顯著減少、萎縮，胞核固縮，局部視細(xì)胞消失(紅箭頭)，雙極細(xì)胞層及節(jié)細(xì)胞層變化不明顯。

2結(jié)果

正常對(duì)照組的大鼠眼脈絡(luò)膜結(jié)構(gòu)完整，可見致密纖維結(jié)締組織；色素上皮層由2～3層梭形上皮細(xì)胞組成，胞質(zhì)內(nèi)含少量色素顆粒；視細(xì)胞層排列整齊，約10余層視細(xì)胞核組成，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清楚，雙極細(xì)胞層結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，約6層細(xì)胞核重疊排列，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層呈單層疏松排列，局部可見小血管(圖7A)。藍(lán)光照射3h實(shí)驗(yàn)組的大鼠眼脈絡(luò)膜致密纖維結(jié)締組織玻璃樣改變，局部疏松水腫，小血管增生，色素層變薄，細(xì)胞稀疏；視細(xì)胞數(shù)量減少約5～6層，細(xì)胞核染色清晰，雙極細(xì)胞層及節(jié)細(xì)胞層未見明確改變(圖7B)。藍(lán)光照射6h實(shí)驗(yàn)組的大鼠眼脈絡(luò)膜層疏松水腫，小血管增生；色素層變薄，細(xì)胞稀疏，視細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少，約4～5層，細(xì)胞核固縮；雙極細(xì)胞層輕度增生，細(xì)胞核淡染；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層局部胞漿豐富，向內(nèi)側(cè)形成胞突，小血管增生(圖7C)。藍(lán)光照射12h實(shí)驗(yàn)組的大鼠眼脈絡(luò)膜層疏松水腫，小血管增生；色素層變薄，細(xì)胞疏松；視細(xì)胞顯著減少、萎縮，細(xì)胞核固縮，大部分視細(xì)胞層細(xì)胞核1～2層，并逐漸減少，局部視細(xì)胞消失；雙極細(xì)胞層及節(jié)細(xì)胞層變化不明顯(圖7D)。

3討論

隨著LED光源大量應(yīng)用，短波藍(lán)光造成的潛在視網(wǎng)膜損傷應(yīng)該引起重視[2]。視網(wǎng)膜是眼組織中最容易受到光輻射損害的部位，1966年Noell等[3]首次建立大鼠視網(wǎng)膜光損傷動(dòng)物模型。既往研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜光損傷主要累及視網(wǎng)膜的光感受器細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞。大鼠的視網(wǎng)膜光感受器視桿細(xì)胞約占97.2%，而視錐細(xì)胞僅占2.8%[4]。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞參與視黃醇循環(huán)，吞噬脫落的光感受器細(xì)胞外節(jié)以維持光感受器細(xì)胞興奮性，并分泌多種生長因子，幫助維持脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和光感受器細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性[5-7]。既往實(shí)驗(yàn)證明視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞對(duì)藍(lán)光刺激敏感[8]，損傷可造成血視網(wǎng)膜屏障及跨膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生功能障礙[9-10]，故有研究者認(rèn)為，藍(lán)光損傷主要部位為視網(wǎng)膜的色素上皮細(xì)胞，凋亡是其主要表達(dá)方式[11]。

而近年來的研究[12]則更多表明藍(lán)光照射引起的視網(wǎng)膜光損傷其本質(zhì)是光感受器的凋亡。每個(gè)光感受器細(xì)胞外節(jié)內(nèi)含一種感光色素。視桿細(xì)胞外節(jié)所含感光色素為視紫紅質(zhì)(rhodopsin)，視紫紅質(zhì)由11-順視黃醛和視蛋白組成，與光損傷的發(fā)生密切相關(guān)[13]。視黃醛(retiniod)被稱為A2E(N-retinyl-N-retinylideneethanolamine1)[14-16]，A2E有2個(gè)吸收峰，一個(gè)在紫外光區(qū)335nm處，一個(gè)在藍(lán)光區(qū)的435nm處。A2E對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮在沒有光照的黑暗條件下沒有毒性，而光照下毒性大大增加。藍(lán)光對(duì)視網(wǎng)膜的損害是連鎖反應(yīng)：藍(lán)光激發(fā)A2E使其釋放自由基離子，自由基離子增大A2E對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮的損壞，引起視網(wǎng)膜色素上皮萎縮，導(dǎo)致光感受器細(xì)胞的凋亡。

既往國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道多采用點(diǎn)光源藍(lán)光照射實(shí)驗(yàn)，點(diǎn)光源所發(fā)出的光譜距離垂直中心方向越遠(yuǎn)，光照度差異越大。面陣光源在同一平面內(nèi)照射的范圍較大，距離垂直中心方向光照度差異性小，各個(gè)方向的光照度更均勻；國外文獻(xiàn)也有報(bào)道使用面陣光源照射模型[17]，其采用高光無間斷照明，將氙燈匯聚成小光束，經(jīng)過藍(lán)色濾光片或綠色濾光片形成藍(lán)光束-或綠光束，直接短時(shí)間高光照射固定在模具中的大鼠眼睛，其光照時(shí)間與光照均勻性的設(shè)計(jì)與本實(shí)驗(yàn)有區(qū)別。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在養(yǎng)殖箱內(nèi)完成，實(shí)驗(yàn)最好選用一塊同養(yǎng)殖箱底面同樣大小的LED顯示屏照射，但因?qū)嶋H條件所限不能實(shí)施。若簡單選用一個(gè)LED光源照射，就會(huì)存在因點(diǎn)光源近距離投射造成不同位置光照度相差較大。為此，綜合考慮箱體大小、大鼠活動(dòng)性，采用由9個(gè)藍(lán)光LED燈構(gòu)成面陣照射，通過國家計(jì)量質(zhì)檢中心檢測驗(yàn)證，實(shí)時(shí)測量養(yǎng)殖箱底部5個(gè)部位(4個(gè)角+1個(gè)中心)的照度數(shù)值基本一致，波動(dòng)范圍均在10%以內(nèi)，符合實(shí)驗(yàn)照射要求，可重復(fù)操作性強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案既往未見國內(nèi)外報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)基于455～470nm面陣藍(lán)光發(fā)光器每天分別照射SD大鼠3、6、12h，隨藍(lán)光照射時(shí)間延長，各實(shí)驗(yàn)組大鼠眼脈絡(luò)膜纖維結(jié)締組織玻璃樣改變，局部疏松水腫，小血管增生，色素層變薄，細(xì)胞稀疏，視細(xì)胞數(shù)逐漸減少，局部消失。3h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核染色清晰，雙極細(xì)胞層及節(jié)細(xì)胞層未見明確改變。6、12h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核固縮，雙極細(xì)胞層輕度增生，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層局部形成胞突。光照時(shí)間越長光感受器細(xì)胞損傷越重，與既往報(bào)道一致。藍(lán)光照射引起視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞變薄疏松，色素上皮細(xì)胞損傷程度與藍(lán)光照射時(shí)間無明顯關(guān)系。由于條件限制未對(duì)大鼠視網(wǎng)膜各層具體厚度及細(xì)胞數(shù)進(jìn)行檢測及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，有待進(jìn)一步完善。

致謝重慶市中醫(yī)研究院病理科曾敏指導(dǎo)病理切片閱片。