醬香型白酒機械化釀造不同輪次堆積發酵 細菌菌群結構多樣性分析

王 歡，席德州，黃永光,，曹文濤，尤小龍，程平言，胡

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州茅臺酒廠（集團）習酒有限責任公司，貴州 習水 564622）

醬香型白酒是中國最傳統、最古老的三大香型白酒之一，也是華夏民族典型的發酵食品之一，以茅臺酒為代表，其他名優酒有習酒、郎酒等。其酒體風格特征為“無色（或微黃）透明，醬香突出，幽雅細膩，醇厚協調，回味悠長，空杯留香持久”[1]。其獨特的釀造工藝可概括為“高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵、高溫餾酒、生產周期長、貯存時間長、用曲量大、多輪次（發酵）取酒”[2]。其中，高溫堆積發酵是醬香型白酒獨特的生產工序之一，也是其釀造工藝中最難掌控的關鍵環節，具有“次制曲”之說[3]。堆積發酵過程可自然網羅、富集釀造環境中的微生物，形成獨特的微生物菌群結構，其過程所富集的微生物菌群代謝產生豐富多的發酵酶類、風味物質對后期酒體醬香風味的形成具有重要作用[1]， 同時也為下一步窖池發酵提供充足的微生物儲備[4-5]。其過程的菌群結構包括酵母菌、細菌、放線菌和霉菌等。其中，細菌是醬香型白酒釀造過程中重要的產香功能微生物，能夠分泌代謝降解蛋白質及淀粉的水解酶類，對酒體的風味質量有著極大貢獻和關鍵調控作用[4]。因，系統研究釀造過程的細菌菌群結構及其演替規律是科學認識和揭示其釀造品質的關鍵。

近年，蓬勃發展的高通量測序及其數理分析研究[6]為深入探索、解析復雜發酵體系的微生物菌群組成和結構提供了有效手段[7-10]。黃蘊利等[11]利用高通量測序研究了醬香型白酒傳統釀造過程發酵酒醅中的微生物菌群結構，發現堆積酒醅中的優勢細菌屬為芽孢桿菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬和乳桿菌屬。郭敏等[12]運用高通量測序技術對醬香型白酒傳統釀造過程發酵酒醅的微生物菌群結構也進行了研究，揭示了發酵過程優勢菌屬與產酒之間的機制。李欣等[13]通過高通量測序技術對醬香型白酒傳統釀造不同發酵階段的優勢菌屬進行研究，揭示了優勢菌屬對醬香型白酒生產的功能作用。但上述研究主要集中在于單一輪次或傳統釀造過程中菌群結構的研究，缺乏對整個輪次堆積發酵全過程系統性的研究和解析，也缺乏對各輪次微生物結構之間多性、異同性的系統分析。隨著濃香白酒領域的洋河[14]、今世緣的高度機械化[15]，清香型的勁酒機械化快速發展[16]，在傳統白酒行業掀起了新的機械化創新發展。機械化釀造不但可降低傳統模式的勞動強度，還可提升釀造質量的穩定性和可控性。

為揭示機械化釀造過程中不同輪次堆積發酵微生物菌群結構的多性、差異性，利用高通量測序及其數理分析，對醬香型白酒機械化釀造不同輪次堆積發酵酒醅中的微生物菌群結構及其多性等進行系統研究，為機械化釀造醬香型白酒的發展和工藝優化提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DNA試劑盒 美國Omega BioTek公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增引物 北京全式金生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；E002092超凈工作臺 蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；渦旋振蕩器 北京同正生物技術發展有限公司；PCR儀 美國伯公司； 電泳儀 北京六一儀器廠；凝膠成像系統 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

圖 1 堆積酒醅取樣Fig. 1 Sampling points for stacking fermented grains

1.3.3 PCR擴增及凝膠電泳

細 菌 P C R 擴 增 引 物 ： 3 3 8 F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）；PCR體系：10h Buffer 2 mL，dNTPs 2 μL，正反引物各0.8 μL，rTaq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 12.2 μL，總計20 μL反應體系。PCR條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，29 個循環；72 ℃再 延伸10 min。

凝膠電泳： 1 % 瓊脂糖凝膠， 核酸染料（Gengreen），電壓90 V，電泳時間40 min。

1.3.4 高通量測序

采用Illumina高通量測序技術，基于Illumina MiSeq測序平臺，分別對細菌V4高變區序列進行測序分析（由專業檢測公司完成）。

1.3.5 理化指標的測定

水分測定采用135 ℃的烘干法；酸度測定采用酸堿滴定法；淀粉、還原糖檢測采用斐林試劑法。具體參照DB 34/T 2264ü 2014《固態發酵酒醅分析方法》[17]。

1.3.6 機械化釀造工藝

本機械化釀造工藝流程與傳統釀造工藝流程相同，主要是在釀造過程采用機械化代替人工操作，具體概述如下：應用潤糧設備代替人工潤糧，采取三段式潤糧，控制每段的潤糧時間、水分和溫度；蒸糧蒸酒采用機械設備自動上甄，上甄下料采用垂直式下料、紅外感應見汽下料，做到疏、松、勻、薄、輕、平等要求；攤涼、下曲、拌勻、運醅均為一體式機械設備，在線風冷攤涼、自動計量下曲、絞龍拌勻、傳送帶運醅，按工藝參數控制過程工藝參數，嚴格模擬傳統釀造工藝要求；堆積采用垂直式、轉盤設備下醅、堆積，地面堆積，參數控制按傳統工藝執行；下窖、起窖采用傳統釀造的行車、抱斗，工藝操作和控制嚴格執行傳統工藝要求。

1.4 數據及圖像處理

采用Microsoft Office Excel 2016進行數據計和分析。基于Illumina MiSeq測序平臺，群落組成圖、Heatmap圖、冗余分析圖利用R語言工具，物種相關性網絡運用Cytoscape軟件，豐度圖利用Origin軟件進行繪制。

2 結果與分析

2.1 細菌菌群結構多性

圖 2 酒醅樣品中的細菌群落結構（門水平）Fig. 2 Bacterial community structure of fermented grain samples at phylum level

圖 3 酒醅樣品中的細菌群落結構（屬水平）Fig. 3 Bacterial community structure of fermented grain samples at genus level

如圖3所示，在屬水平上，不同輪次機械化釀造堆積發酵酒醅中的細菌菌群在數量及結構分布上多性特征明顯，但菌群的屬類種別基本一致，1輪次共檢測出130 個屬，2輪次126 個屬，3輪次129 個屬，4輪次119 個屬，5輪次125 個屬，6輪次164 個屬，7輪次136 個屬。1輪次的菌屬分布較均勻，相對豐度大于1%的有10 個屬，包括Acinetobacter、Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Pediococcus、Sphingomonas、Thermoactinomyces和Weissella，其中以前5 種為主（總相對豐度為84.74%）。從2輪次開始，Acinetobacter的相對豐度均大于50%，成為主導菌屬。其中，2輪次的菌群多性有所降低，共6 個屬的相對豐度大于1%，包括Acinetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus和Thermoactinomyces。3、4、5輪次的產酒酒質最好，出酒率也高，被稱為“大回酒”[19]，且4、5輪次香氣特征較為相似，圖3 表明其菌群結構也較相似。其中，3輪次有9 個屬相對豐度大于1%，主要是Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Sphingomonas和Thermoactinomyces。4輪次有9 個屬相對豐度大于1%，以Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Rhodococcus、Sphingomonas和Thermoactinomyces為主。5輪次相對豐度大于1%的有8 個屬，包括Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus和Sphingomonas。6、7輪次的菌群結構也相似，6輪次有9 個屬相對豐度大于1%，包括Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Rhodococcus和Sphingomonas；7輪次共有8 個相對豐度大于1%的屬，包括Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus和Sphingomonas。機械化釀造各個輪次堆積酒醅中的共有優勢菌屬主要為Acinetobacter、Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus和Kroppenstedtia，這些菌屬在部分輪次中的相對豐度都在5%以上。上述結論表明，在醬香型白酒機械化釀造的各輪次之間參與堆積發酵并富集的微生物菌群結構多性特征非常明顯，其各輪次的菌群結構共性特征顯著性大于差異性，說明各輪次釀造的釀酒微生物穩定性較好，也表征了醬香型白酒釀造過程存在固有的特征性菌群結構。

2.2 核心微生物菌群及其功能

研究表明[20-22]，平均相對豐度大于1%且至少出現在一個品以上的菌屬被定義為核心微生物屬。本研究發現，機械化釀造不同輪次堆積發酵酒醅中的細菌平均豐度大于1%且至少出現在1 個品以上的屬有12 個，分別是Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Pediococcus、Rhodococcus、Sphingomonas、Thermoactinomyces和Weissella。如圖4所示，該12 個菌屬1～7輪次總相對豐度分別為97.98%、97.82%、97.20%、98.28%、97.52%、95.57%、95.51%，說明這12 個菌屬一直穩定存在于醬香型白酒機械化釀造的堆積發酵過程，而且成為主導性菌群結構，可將其認為是機械化釀造堆積發酵過程的核心微生物結構菌群。其中，Acinetobacter、Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus和Kroppenstedtia在7 個輪次中的相對豐度均大于1%，且后4 種（Lactobacillus、Bacillus、Lentibacillus和Kroppenstedtia）為傳統釀造酒醅中的優勢菌群和功能菌群，對酒體醬香風味的形成具有重要貢獻[23]。

圖 4 酒醅樣品中的核心細菌群落豐度圖（屬水平）Fig. 4 Abundance of core bacterial community in fermented grain samples at genus level

如圖4所示，Acinetobacter在1～7輪次機械化釀造堆積發酵酒醅中均為絕對優勢菌屬，但1輪次中的Acinetobacter含量較其余幾個輪次少，而在4、5輪次發酵酒醅中的豐度含量最高，可能的原因是1輪次釀造正處于寒冬季節，環境溫度較低，微生物生長較緩慢，而4、5輪次生產恰逢5、6月份，較高的環境溫度與空氣濕度為其提供了良好的生長條件。Acinetobacter主要來源于釀酒環境的空氣[24]和生產用大曲[25]，是一種釀造環境優勢細菌。該菌屬也在傳統釀造堆積發酵酒醅中檢出，郭敏等[12]發現其在第7輪次發酵中的豐度較高（13.26%），在2、3輪次中其豐度則低于1%。該菌屬成為機械化釀造堆積發酵中的絕對優勢菌屬，其可能源于機械攪拌增加了發酵酒醅的破碎率，再加上機械化堆積過程酒醅的堆料方式導致酒醅的緊密度過高，致使堆積酒醅間的氧容量降低，進而為Acinetobacter提供了良好的生長環境[26-27]，該菌屬的多數菌在白酒釀造過程主要利用糖類物質產酸，改善發酵環境的酸度[28]。Bacillus在1～3輪次中豐度較高（圖4），研究表明[4]其也是大曲中的優勢菌群，是醬香白酒醬香風味物質形成的主要代謝貢獻菌群，能產生蛋白酶與淀粉酶等水解酶類，其水解原料形成豐富的發酵前體物質，有利于風味物質的形成。Pediococcus、Lactobacillus與Weissella屬于乳酸菌菌系，乳酸菌大多是兼性厭氧或厭氧菌[29]，在發酵過程具有重要的生物學結構調控功能[30]。在中國白酒釀造發酵體系中，乳酸菌主要代謝產乳酸，乳酸可與發酵體系中的其他代謝產物發生生化反應合成多種呈香、呈味物質，如乳酸乙酯等[31]。同時，乳酸菌還可促進發酵過程的美拉德反應，增加酒體中的呈香物質；乳酸菌代謝產生的各種有機酸還可維持酸性發酵環境，調控發酵體系中微生物結構間的平衡關系。乳酸桿菌也可利用霉菌等微生物代謝生成的朊、胨和多肽類物質形成氨基酸[32]，氨基酸進一步代謝產生酒體中的風味物質，對醬香風格的形成有重要貢獻。Kroppenstedtia和Lentibacillus均被發現存在于大曲中，其在白酒生產中的具體作用尚不明確。Kroppenstedtia是1輪次中的優勢菌屬（圖4），姚粟等[33]發現其也是高溫大曲中細菌Firmicutes的第2優勢菌屬，且是一種嗜熱菌屬。Thermoactinomyces也是大曲中的優勢菌屬[33]，其在1～7輪次機械化釀造堆積發酵酒醅中的豐度含量隨著輪次的增加而減少（圖4），在5～7輪次中豐度低于1%，李豆南等[34]發現，該菌屬可產生吡嗪和芳香類物質，對醬香型白酒的風味具有重要的作用。劉洋等[35]發現該菌屬發酵代謝產堿性磷酸酶、酯酶、脂質酯酶和萘酚AS-BI磷酸水解酶，還具有糖化力、液化力和較高的蛋白質分解力，可降解釀酒原料中的淀粉、蛋白等生成香味物質。圖4表明，Sphingomonas在機械化釀造堆積發酵過程隨發酵輪次遞增，豐度呈現一致的增加趨勢。同時，該菌屬能夠降解芳香類化合物和產生多糖類物質[36]，還具有較強的產輔酶Q能力[29]，該菌屬也存在于傳統釀造堆積發酵的部分輪次中[37]。在機械化釀造中還檢測到大量的Caulobacter，該菌屬在1、2輪次中豐度含量較低，6、7輪次中含量最高，其在傳統釀造堆積發酵酒醅中鮮見報道，是機械化釀造過程中的特有菌屬，可能來源于機械設備和環境，在白酒發酵過程中的作用還有待進一步研究。Rhodococcus在整個群落結構中所占比例很小（圖4），是一類可以從土壤等環境中分離獲得的革蘭氏陽性菌，屬于Actinobacteria，可分泌大量的活性酶，能夠充分利用有機化合物作為能源和碳源，對石油烴、有機腈和霉菌毒等具有降解 作用[38]，且具有降解白酒釀造廢水的功能[39]。華茍 根等[40]等發現Rhodococcus屬的fascians可降解檸檬苦，增加苦味果汁的香氣。該菌屬在傳統釀造堆積發酵酒醅中鮮見報道，在白酒中的功能還有待進一步研究。上述結論表明，在機械化釀造堆積發酵過程其核心菌群結構相對性穩定程度高，對堆積發酵整體菌群結構的變化調控功能明顯，這也是醬香型白酒釀造過程需要堆積發酵的必要，為下一步窖池發酵的微生物多性和穩定的菌群結構研究提供參考依據，實現高產和優質的前提條件。

2.3 核心微生物的相互作用

圖 5 酒醅樣品中的核心細菌群落相關性網絡圖（屬水平）Fig. 5 Network of core bacterial community in fermented grain samples at genus level

為深入挖掘特定環境中復雜微生物群落物種之間相關性，系統認識核心微生物菌群之間的相互關系及其調控機制，將12 個核心細菌屬進行物種相關性網絡分析。如圖5A所示，12 個核心細菌屬之間具有極其復雜的相互生物學作用，這些復雜的共生關系和拮抗關系形成了穩定的微生物群落結構，這也是發酵過程微生物菌群穩定性和演替的內在調控動力和機制。Bacillus、Lactobacillus、Thermoactinomyces、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Weissella、Pediococcus和Oceanobacillus屬于Firmicutes，它們之間絕大部分呈現共生關系 （圖5B）。其中，Bacillus與Thermoactinomyces極顯著正相關（P＜0.01）；Kroppenstedtia與Lentibacillus極顯著正相關（P＜0.01）。Pediococcus與Thermoactinomyces顯著正相關（P＜0.05）。Weissella與Thermoactinomyces、Lentibacillus顯著正相關（P＜0.05）。Acinetobacter、Caulobacter和Sphingomonas屬于Proteobacteria，Rhodococcu屬于Actinobacteria，從圖5C可知，該3 個菌屬和其他9 個基本都呈現負相關。其中，Acinetobacter與Kroppenstedtia顯著負相關（P＜0.05）；Caulobacter與Thermoactinomyces和Weissella顯著負相關（P＜0.05）；Thermoactinomyces與Sphingomonas和Pediococcus極顯著負相關（P＜0.01），與Bacillus顯著負相關 （P＜0.05）；Rhodococcus與Weissella極顯著負相關 （P＜0.01）。Caulobacter與Rhodococcus和Sphingomonas極顯著正相關（P＜0.01）。從核心菌屬之間的相關性結果表明，在堆積發酵的菌群多性復雜體系中，正是因為核心菌群之間形成的共生、拮抗等生物學關系，才構成了復雜體系中的協同共生關系，維持整個發酵體系的正常、穩態發展，推進釀造進程沿襲乙醇發酵和風味富集方向發展。

2.4 環境因子對核心細菌菌群結構的影響

圖 6 環境因子對核心細菌群落的影響Fig. 6 Effects of environmental factors on core bacterial communities

圖 7 核心細菌群落與環境因子的相關性HeatmapFig. 7 Heatmap for the correlation between core bacterial communities and environmental factors

核心微生物受環境因子影響也較大，如圖7 所示，Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus和Weissella均與淀粉含量顯著正相關（R分別為0.929、1、0.786、0.786），且Bacillus與淀粉含量極顯著正相關 （P＜0.01），Thermoactinomyces與淀粉含量高度顯著正相關（P＜0.001）。這主要因為Bacillus能產生蛋白酶與淀粉酶等水解酶類，水解原料形成豐富的發酵前體物質[4]，而Thermoactinomyces具有糖化力、液化力和較高的蛋白質分解力，可降解釀酒原料中的淀粉、蛋白等生成香味物質[34]。Caulobacter與淀粉含量顯著負相關（P＜0.05，R=0.821）、Sphingomonas與淀粉含量極顯著負相關（P＜0.01，R=0.929），因為Sphingomonas降解芳香類化合物；Caulobacter可能來源于機械設備或環境。還原糖含量對核心微生物沒有影響。Caulobacter和Sphingomonas與水分顯著正相關（R分別為0.857、0.964），其中Sphingomonas高度正相關 （P＜0.001），而Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus與水分顯著負相關（R分別為0.857、0.964、0.893），且Thermoactinomyces和Pediococcus極顯著和高度負相關（P ＜0.0 1，P ＜0.0 0 1）。Sphingomonas與酸度顯著正相關（P＜0.05，R=0.857），而Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus與酸度顯著負相關（R分別為0.857、0.857、0.929），且Pediococcus極顯著負相關（P＜0.01），這說明酸度高、水分大會抑制大部分微生物的生長，不利于發酵的進行，因在生產上要控制Sphingomonas的生長。上述結果表明，在機械化釀造堆積發酵過程，環境因子水分、淀粉含量和酸度與核心細菌菌群中的菌屬之間具有密切的相關性，表明堆積發酵過程水分、淀粉含量和酸度對微生物生長具有緊密的調控作用，共同形成推動發酵過程的微生物菌群結構，促進釀造發酵的正常進行。

3 結 論

本研究利用高通量測序及數理分析方法系統性研究醬香型白酒機械化釀造不同輪次堆積發酵酒醅中的細菌菌群結構特征，7 個輪次中共檢測出14 個門，456 個屬，優勢菌門為Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes；在屬水平上，不同輪次堆積發酵酒醅中的細菌菌群在數量及結構分布上多性特征明顯，且主要核心菌群種類基本一致。根據各菌群豐度將12 種菌群定義為醬香白酒機械化釀造的核心細菌屬，分別是Acinetobacter、Bacillus、Caulobacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Pediococcus、Rhodococcus、Sphingomonas、Thermoactinomyces和Weissella。核心微生物菌群之間的物種相關性網絡分析結果表明，Bacillus、Lactobacillus和Sphingomonas在醬香型白酒機械化釀造各輪次發酵過程堆積發酵核心微生物菌群中具有重要的生物學調控作用；Caulobacter與大部分核心微生物存在拮抗作用，Oceanobacillus與大部分核心菌屬屬于共生關系。堆積發酵過程的環境因子中，水分、酸度、淀粉含量對微生物群落結構影響較大，產生了重要的調控作用，其中Bacillus、Thermoactinomyces、Pediococcus與淀粉含量顯著正相關，與水分、酸度顯著負相關；Caulobacter、Sphingomonas與淀粉含量顯著負相關，與水分含量顯著正相關，Sphingomonas還與酒醅酸度顯著正相關。本研究為推進醬香型白酒機械化釀造發展提供了基礎理論和學科依據。