蔡 雋，沈文遠，王 慧，譚 珵，趙秀梅，沈嘯洪*

(1.天津市醫藥科學研究所 腫瘤藥物研發中心，天津 300020；2.南開大學 醫學院，天津 300071；3.天津醫科大學總醫院 骨科，天津 300052)

胰腺癌(pancreatic cancer)是一種發病隱匿、進程快、預后極差的惡性腫瘤，發病率呈逐年增長趨勢，成為威脅人類健康的重要因素[1]。胰腺癌主要臨床病理特征是腫瘤細胞周圍存在著大量的纖維組織以及豐富的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分，ECM的作用機制研究是近年來的研究熱點。肌腱蛋白C(tenascin-C，TNC)作為一種重要的ECM成分，在胰腺癌組織及其浸潤邊緣高表達，并與胰腺癌轉移和預后差密切相關[2-3]，但目前TNC分子對胰腺癌轉移作用的分子機制尚未明確，而且大多數對TNC生物學作用的研究常局限于TNC分子的外源合成或敲除，對TNC過表達的研究較少。本研究擬采用獨特的PCR引物設計方法，構建重組人源TNC的真核表達質粒，并建立穩定過表達TNC的胰腺癌細胞系PANC1-TNC，檢測分析其細胞遷移、侵襲能力以及上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)相關標志物的表達，以探討TNC在胰腺癌轉移過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系、質粒及菌株：人胰腺癌細胞系PANC1(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)；pBS-HxB.L質粒(Addgene #65414)(北京中原合聚經貿有限公司)；真核表達載體pCMV6-Entry(OriGene公司)；菌株E.coliDH5α感受態細胞(北京全式金公司)。

1.1.2 試劑及試劑盒：Ex Taq酶、限制性內切酶KpnⅠ、EcoRⅤ及T4連接酶(大連寶生物有限公司)；質粒小提及純化試劑盒(Axygen公司)；G418(Sigma Aldrich公司)；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑、SYBR和LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；Transwell小室(BD公司)；抗TNC抗體、辣根過氧化物酶標記(HRP)的羊抗鼠抗體和HRP標記的羊抗兔抗體(Santa Cruz公司)，抗β-actin、E-cad和N-cad抗體(CST公司)。

1.2 方法

1.2.1 人TNC基因的引物設計與合成：根據NCBI數據庫中人TNC基因的序列信息，使用Oligo7.0軟件進行引物設計。在上下游引物中分別引入限制性酶切位點(劃線處)，上游引物：5′-GGGGTACCAG CAGCACCCAGCCAAACC-3′(KpnⅠ)及下游引物：5′-ATCTGCCCGTTTGCGCCTGCCTTCAA-3′(EcoRⅤ)。隨后由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 重組人源TNC真核表達質粒的構建與篩選：以pBS-HxB.L質粒為模板，根據Primer STAR?GXL DNA Polymerase使用說明，進行PCR程序設定。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化TNC擴增產物，使用KpnⅠ單酶切，將其連接于KpnⅠ/EcoRⅤ雙酶切的pCMV6-Entry載體上，構建人TNC真核表達質粒。將TNC質粒轉化DH5α感受態細胞，選取單一菌落加入LB液體培養基(含卡那霉素)37 ℃培養10 h。

1.2.3 細胞的轉染與G418篩選：將構建好的TNC質粒按照脂質體Lipofectamine 2000使用說明書轉染PANC1細胞，轉染48 h后，開始加入含有G418的培養液，隨后根據細胞增殖速度更換培養液。待組成克隆的細胞數約為60個時，胰蛋白酶消化細胞并進一步擴大培養，獲得穩定表達TNC的PANC1細胞系(PANC1-TNC)。以pCMV6-Entry空載體穩定轉染的PANC1(PANC1- vector)細胞和未處理的PANC1(PANC1-WT)細胞作陰性和空白對照。

1.2.4 RT-qPCR檢測TNC mRNA的表達：收集細胞進行總 RNA的提取和反轉錄，采用SYBR法檢測細胞中TNC的mRNA表達水平，上游引物：5′-GCTG GAAAGAAAGCACTCCC-3′，下游引物：5′-CCTCA AATGCCATCCCC TC-3′，同時以GAPDH為內參，上游引物：5′-TGACGCTGGGGCTGGCATTG-3′，下游引物：5′-GCTCTTGCTGGGGCTGGTGG-3′，RT-qPCR的CT值的差即△Ct，2-△△Ct則為該樣本中TNC基因相對于GAPDH mRNA的表達量。

1.2.5 Western blot檢測TNC蛋白的表達：分別收集PANC1-WT/vector/TNC細胞上清，檢測蛋白濃度，每樣品取40 μg總蛋白，經SDS-PAGE分離后轉至PVDF膜上。5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，加抗TNC抗體(一抗)，4 ℃孵育過夜。TBS-T洗膜3次后，HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，再次洗膜后進行ECL化學發光，化學發光儀拍照后，用ImageJ分析條帶的吸光度(A)值。

1.2.6 Transwell小室法檢測遷移和侵襲：取對數期的細胞，胰蛋白酶消化后，細胞計數。上室加入500 μL含2.5×104個細胞的無血清RPMI-DMEM重懸液，遷移/侵襲下室加入750 μL含20% 胎牛血清的培養液。遷移/侵襲小室分別置于孵箱培養24/48 h后，用棉簽擦去小室內的細胞，4%多聚甲醛固定20 min，Gimesa染色20 min后去離子水洗3遍，封片，鏡下觀察計數并采集圖像。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 TNC真核表達質粒的構建與鑒定

以pBS-HxB.L原核表達質粒為模板，使用TNC引物擴增目的條帶，產物片段大小與理論值相符。回收并純化TNC擴增產物，將其連接于pCMV6-Entry載體上，重組人源TNC真核表達質粒(圖1A)。TNC質粒經KpnⅠ和EcoRⅤ雙酶切鑒定，分別得到與預期分子質量大小一致的片段長度(圖1B)。質粒測序以及BLAST序列比對的結果也表明TNC真核表達質粒構建成功。

2.2 PANC1-TNC細胞系的構建與鑒定

與對照細胞相比，PANC1-TNC細胞中TNC mRNA和蛋白表達分泌量均顯著增加(圖2)。

2.3 PANC1-TNC細胞形態學改變

PANC1-TNC細胞較PANC1-vector細胞呈現出不同的細胞表型。顯微鏡下觀察，PANC1-vector細胞多為類橢圓形、連接緊密的上皮細胞形態，而PANC1-TNC細胞明顯變得細長、偽足增多，間質化特征更加明顯(圖3)。

圖1 TNC表達質粒的構建示意圖(A)與鑒定(B)Fig 1 Schematic diagram (A) and identification (B) of the TNC expression plasmid

2.4 過表達TNC增強PANC1的遷移、侵襲運動能力

PANC1-TNC細胞發生遷移、侵襲的細胞數顯著多于對照組。說明過表達TNC可增強PANC1的遷移和侵襲能力(圖4)。

2.5 PANC1-TNC細胞發生EMT相關分子變化

間質標志物N-cadherin蛋白表達量均明顯增多(P<0.05)，而上皮標志E-cadherin在PANC1-TNC細胞中表達減少(P<0.05)(圖5)。

3 討論

胰腺癌惡性度極高，近年來其發病率逐年升高，嚴重威脅人類健康[1]。隨著人們對胰腺癌生物學行為認識的不斷加深，腫瘤微環境關鍵分子TNC在胰腺癌發生發展中所起的作用也受到越來越多的關注[4-6]。研究TNC對胰腺癌發生發展的作用以及腫瘤基質與腫瘤生長之間相互作用的分子機制，對胰腺癌早期診斷、治療與預防有著重要的意義。

本研究構建了TNC真核表達質粒以及穩定過表達TNC的胰腺癌細胞系。本實驗以pBS-HxB.L原核表達質粒為模板，避免了因TNC基因長度較長而造成的PCR克隆難度大的限制，提高了PCR產物的完整性和準確性。為了能夠將TNC基因完整插入到pCMV6-Entry真核表達載體上，本研究設計的下游引物以EcoRⅤ(平末端)結尾，PCR產物可直接獲得EcoRⅤ剪切后的互補核酸序列，從而既免除了TNC序列內部EcoRⅤ酶切位點可能對序列造成的破壞，又能將其完整插入到pCMV6-Entry真核表達載體中，這種方法優于其他質粒的構建[7]，質粒表達穩定。TNC真核質粒的構建不僅可以應用于TNC分子機制的基礎研究，而且這種質粒構建的方法還可以為構建其他超長基因質粒提供新的設計思路。

圖3 PANC1-vector和PANC1-TNC細胞形態觀察Fig 3 Cell morphology of PANC1-vector and PANC1-TNC(scale bar=20 μm)

*P<0.05 compared with control圖4 過表達TNC增強PANC1的遷移(A)和侵襲(B)能力Fig 4 Over-expressing of TNC promoted the migration (A) and invasion (B) ability of n=3)

*P<0.05 compared with control圖5 Western blot分析PANC1細胞系E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達Fig 5 Western blot analysis E-cadherin and N-cadherin expression in PANC1 cell n=3)

EMT與腫瘤轉移密切相關，在此過程中，連接緊密的上皮細胞喪失極性，獲得間質表型特征，細胞浸潤和轉移能力增加[8-9]。本研究在PANC1-TNC細胞系的培養過程中觀察發現，細胞較對照細胞更為細長；Transwell實驗結果也顯示，PANC1-TNC細胞的遷移和侵襲能力顯著增強。這些生物學行為變化提示，TNC可能誘導胰腺癌細胞發生EMT，結合TNC可通過調控EMT增強乳腺癌、結直腸癌細胞遷移能力[10-12]的研究報道，本研究對PANC1細胞中的EMT相關分子進行了檢測。結果發現，穩定過表達TNC的PANC1細胞中E-cadherin表達減少、N-cadherin表達增加，這就表明TNC過表達可誘導PANC1細胞發生EMT，誘導腫瘤細胞遷移與侵襲，這與以往的臨床觀察報告相一致[2-3]。因此，TNC可能是調節胰腺癌生長和發展的關鍵分子，也可作為胰腺癌早期診斷和治療的新靶點，其相關分子機制需進一步研究證實。