球等鞭金藻Cryl-like基因克隆及生物信息學(xué)分析

龔林，趙靖悅，雷娜娜，胡榮飛，陳由強(qiáng)，薛婷，何文錦

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院海洋生物醫(yī)藥與制品產(chǎn)業(yè)化開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺(tái)，福建 福州 350117；2.福建師范大學(xué)南方海洋研究院福建省微藻種質(zhì)改良工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350117）

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，會(huì)受到各種環(huán)境條件的影響，其中光的影響至關(guān)重要。光對(duì)植物的作用有兩方面：一方面是給植物進(jìn)行光合作用提供必不可少的能量，另一方面可以調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，即光形態(tài)建成或光控發(fā)育[1]。在植物光形態(tài)建成過程中感受光信號(hào)的物質(zhì)是光受體，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)植物主要有2種光受體：一是紅光受體，即光敏色素(phytochrome)，接受紅光或遠(yuǎn)紅光；二是藍(lán)光受體，接受藍(lán)光或紫光，而藍(lán)光受體包含隱花色素(cryptochrome)和向光素(phototropin)兩種[2]。

隱花色素存在于細(xì)菌、植物、動(dòng)物和人體內(nèi)，分為3類：動(dòng)物隱花色素、植物隱花色素和DASH隱花色素。有研究表明，除了DASH隱花色素具有修復(fù)單鏈DNA的功能[3]之外，其它隱花色素都沒有DNA修復(fù)功能。在Cry1和Cry2的C端包含一個(gè)可變區(qū)域，即功能區(qū)域；N端有2種分子，一個(gè)是甲基四氫葉酸MTHF，另一個(gè)是FAD[4]。Cry1和Cry2主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，是一類吸收藍(lán)光(400～500 nm)和近紫外光(320～400 nm)的光受體，在藍(lán)紫光區(qū)有3個(gè)吸收峰(通常在450、420、480 nm左右)，在近紫外光區(qū)有1個(gè)吸收峰(通常在370～380 nm），不同植物對(duì)藍(lán)光效應(yīng)的作用光譜稍有差異。經(jīng)過長(zhǎng)期研究，現(xiàn)己知隱花色素在植物種子萌發(fā)中起去黃化作用，光周期誘導(dǎo)開花和起調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律作用[5]。

藍(lán)光對(duì)藻類生長(zhǎng)發(fā)育及代謝物生成積累影響機(jī)制的相關(guān)研究不斷深入。有研究表明，藍(lán)光可調(diào)控萊茵衣藻的細(xì)胞周期循環(huán)、節(jié)律、葉綠素及類胡蘿卜素合成等相關(guān)生理過程[6]；藍(lán)光可以有效誘導(dǎo)雨生紅球藻蝦青素的合成與積累，對(duì)雨生紅球藻蝦青合成積累具有重要影響[7]。隱花色素結(jié)構(gòu)與功能在微藻中研究日漸深入，目前在模式微藻三角褐指藻、萊茵衣藻和金駝球藻中均有相關(guān)研究和報(bào)道[8～10]。球等鞭金藻近緣物種海洋球石藻等物種隱花色素基因在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上已有發(fā)表，但是球等鞭金藻隱花色素基因功能與結(jié)構(gòu)等方面研究尚未見報(bào)道，其基因組數(shù)據(jù)庫(kù)也尚未發(fā)表。

本研究以球等鞭金藻為材料，在實(shí)驗(yàn)室建立的球等鞭金藻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中查找出一條隱花色素基因——Cryl-like，通過PCR獲取該基因DNA全長(zhǎng)、重疊延伸PCR獲取其cDNA全長(zhǎng)。對(duì)Cryl-like基因進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、二三級(jí)結(jié)構(gòu)等相關(guān)生物信息學(xué)分析，為后續(xù)探討球等鞭金藻中隱花色素響應(yīng)藍(lán)光機(jī)制提供理論依據(jù)，為隱花色素參與球等鞭金藻光響應(yīng)機(jī)制等方面的功能研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

球等鞭金藻 (Isochrysis galbana)藻種來源于上海光語(yǔ)生物科技有限公司。培養(yǎng)周期為光∶暗=12h∶12h，光照強(qiáng)度3500 lux，溫度18 ℃，培養(yǎng)于錐形瓶中。培養(yǎng)基采用f/2 培養(yǎng)基[11]。

HiFi Taq DNA聚合酶、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自TransGen；pMD 19-T載體購(gòu)自Takara；膠回收試劑盒購(gòu)自Tiangen；氨芐青霉素(Amp)購(gòu)自上海生物工程公司；其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因序列獲取

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上擬南芥隱花色素基因蛋白序列，與本實(shí)驗(yàn)室建立的球等鞭金藻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)找出同源序列Cryl-like基因蛋白序列。再?gòu)那虻缺藿鹪寤蚪M和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)分別查找出Cryl-like基因DNA和cDNA序列，其中DNA序列全長(zhǎng)2913 bp，cDNA序列全長(zhǎng)2316 bp。

1.2.2 基因組DNA、RNA的提取

取培養(yǎng)2周處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的球等鞭金藻藻液，參照微藻CTAB法[11]提取基因組總DNA。總RNA的提取參照Trizol說明書。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA、RNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。

1.2.3 PCR反應(yīng)

利用引物設(shè)計(jì)軟件primer5設(shè)計(jì)球等鞭金藻Cryl-like基因DNA、cDNA全長(zhǎng)序列特異性引物，引物由上海生工生物公司合成。5'端引物（F）：5'-ATGCGTGTCGAGCTTTTCGTG-3'；3'端引物（R):5'-TCAGCGCATATACTTCTTTATGCTG-3'。

PCR反應(yīng)體系為50 uL(含10×buffer 5 uL，dNTP Mixture[each 2.5 mmol/L]4ul，GC enhancer 5 ul，上下游引物各2 ul，DNA或cDNA模板1 uL， HiFi Taq酶0.4 uL，加適量滅菌超純水到50 ul)。PCR擴(kuò)增熱循環(huán)為：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物取2 ul，使用1%瓊脂糖凝膠電泳分析并純化回收。

1.2.4 目的基因片段的克隆及測(cè)序

采用Tiangen膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，隨后將回收產(chǎn)物與pMD-19t載體進(jìn)行16 ℃過夜連接，連接酶選用Ligation Solution I。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于帶有氨芐青霉素抗性瓊脂平板。通過菌液PCR篩選出陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆搖菌過夜再提取質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序。

1.2.5 序列生物信息學(xué)分析主要運(yùn)用的生信分析軟件和網(wǎng)站

蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)和分子量的計(jì)算使用ExPASy的ProtParam 程序（https://web.expasy.org/protparam/）；

蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用SignalP 4.0在線網(wǎng)站（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）；

蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)采用NetPhos (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)；

蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)采用Cell-PLoc 2.0 的Euk-mPLoc 2.0在線程序分析(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/)；

蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)采用ExPASy主頁(yè)上的Interpro在線程序（https://www.ebi.ac.uk/interpro/beta/）

蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別采用ExPASy的SOPMA程序（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISSMODEL程序（https://swissmodel.expasy.org/）；

蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)使用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)；

同源序列查找使用NCBI的BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；

蛋白質(zhì)同源序列比對(duì)采用Clustalx軟件，比對(duì)結(jié)果優(yōu)化使用DANman軟件；

MEGA7 軟件以最大似然法（Maximum likelihood）構(gòu)建進(jìn)化樹，分支置信度經(jīng)1000次自舉重復(fù)測(cè)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 以球等鞭金藻基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以球等鞭金藻基因組DNA為模板對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)，與 5000 bp Ladder Marker進(jìn)行比較，可見擴(kuò)增片段約為3000 bp，與Cryl-like基因組DNA序列大小吻合，見圖1。

2.2 PMD19-T克隆后檢測(cè)結(jié)果

PMD19-T載體大小為2692 bp，與片段大小為2916 bp的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接后重組質(zhì)粒大小約為5700 bp。PMD19-T與Cryl-like基因重組質(zhì)粒（下文稱PMD-Cry1-like質(zhì)粒）凝膠電泳圖顯示重組質(zhì)粒片段大小與預(yù)期一致（圖2）， 基因成功連接至PMD19-T質(zhì)粒上。將PMD-Cry1-like質(zhì)粒送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與球等鞭金藻Cryl-likeDNA全長(zhǎng)序列比對(duì)，兩者序列一致，通過PCR方式順利克隆得到CryllikeDNA全長(zhǎng)。

2.3 重疊延伸PCR獲取Cryl-like基因cDNA全長(zhǎng)

表1 重疊延伸PCR各分段引物

以球等鞭金藻cDNA為模板對(duì) C ry1-like 基因cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行多次PCR無果，隨后采用重疊延伸PCR。利用NCBI網(wǎng)站上的splign程序在線對(duì)比DNA和cDNA全長(zhǎng)序列，找出Cryl-like基因內(nèi)含子和外顯子各分段序列，見圖3。依據(jù)圖3顯示的Cryl-like各分段序列，設(shè)計(jì)5'-3'端特異性引物，各分段引物如表1所示。

PCR反應(yīng)條件同1.2.3，模板為PMD-Cry1-like質(zhì)粒。將Cryl-like外顯子分段1、2、3分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳，結(jié)果顯示各分段PCR產(chǎn)物條帶大小合適（圖4）。將分段1、分段2 PCR回收產(chǎn)物為模板進(jìn)行重疊延伸PCR獲得分段1+2片段，再以分段1+2和分段3的回收產(chǎn)物為模板用全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR，從而獲得Cryl-like基因cDNA全長(zhǎng)。連接Cryl-like基因cDNA序列一致，說明成功克隆得到球等鞭金藻Cryl-like基因cDNA全長(zhǎng)。

2.4 球等鞭金藻Cryl-like基因生物信息學(xué)分析

2.4.1 球等鞭金藻Cry1-like蛋白質(zhì)理化性質(zhì)與功能預(yù)測(cè)

使用Protparam在線程序分析Cry1-like蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為8.95，分子式推測(cè)為C3791H5996N1090O1102S30，蛋白質(zhì)分子量為85437.75 Da。不穩(wěn)定指數(shù)為46.29，推測(cè)該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。預(yù)測(cè)在酵母中表達(dá)的半衰期大于20 h，在大腸桿菌中表達(dá)的半衰期大于l0 h，而在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞中體外培養(yǎng)表達(dá)的半衰期為30 h。該蛋白由20種基本氨基酸組成，含量較高的氨基酸殘基是丙氨酸（Ala，11.8%）和亮氨酸（Leu，11.0%），含量較低的氨基酸殘基是半胱氨酸（Cys，1.6%）和組氨酸（His，1.9%）。其帶正電荷氨基酸有89個(gè)(Asp+Glu)，帶負(fù)電荷的氨基酸有100個(gè)(Arg + Lys)。經(jīng)過protscale程序在線分析，氨基酸序列疏水性/親水性預(yù)測(cè)結(jié)果表明，平均疏水性系數(shù)為-0.269，小于0，推測(cè)其為親水性蛋白，其脂肪系數(shù)為84.37。TMHMM在線程序預(yù)測(cè)Cry1-like無跨膜結(jié)構(gòu)。SignalP 4.0預(yù)測(cè)Cry1-like蛋白不存在信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。NetPhos預(yù)測(cè)Cry1-like蛋白可能存在磷酸化位點(diǎn)有72個(gè)，如圖6所示，其中絲氨酸（Serine）有47個(gè)，蘇氨酸有（Threonine）18個(gè)，絡(luò)氨酸（Threshold）有7個(gè)。Euk-mPLoc 2.0預(yù)測(cè)Cry1-like蛋白定位于細(xì)胞核。利用Interproscan對(duì)其蛋白質(zhì)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示球等鞭金藻Cry1-like歸屬于Cryptochrome/DNA photolyase class1家族。

2.4.2 二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

運(yùn)用ExPASy網(wǎng)站上SOPMA在線程序預(yù)測(cè)球等鞭金藻 Cry1-like基因二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該基因主要存在α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)。α-螺旋占比例最高的為約為43.06%，無規(guī)則卷曲約為37.35%，延伸鏈約為11.93%，而β-轉(zhuǎn)角所占比例最少僅為7.65%。采用SWISS-MODEL在線軟件進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，如圖7所示，Cry1-like基因編碼的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)相符，N端區(qū)域主要有含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角組成，C端區(qū)域主要由無規(guī)則卷曲組成。

2.4.3 球等鞭金藻Cry1-like基因保守域分析

通過PCR得到Cry1-like基因全長(zhǎng)cDNA后，將序列提交至NCBI網(wǎng)站CDD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)該基因的保守域進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該基因存在多個(gè)隱花色素家族基因結(jié)構(gòu)的保守域，如8-羧基-7,8二脫甲基-5-脫氮核黃素（8HDF）、甲基四氫葉酸(MTHF)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等[12]，并且Cry1-like基因含有上述三個(gè)保守域結(jié)構(gòu)均較為完整（圖8）。由此可以初步證實(shí)，球等鞭金藻Cry1-like基因?qū)儆陔[花色素家族基因成員。

2.4.4 氨基酸序列同源性比對(duì)及序列進(jìn)化分析

采用NCBI中的BlastP在線程序查找 Cry1-like的同源氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)球等鞭金藻Cry1-like氨基酸序列與多個(gè)微藻隱花色素相關(guān)氨基酸序列同源性較高，其中有海洋球石藻（Emiliania huxleyi CCMP1516）EhCRY1（XP_005777116.1）、金藻屬Chrysochromulina sp.CCMP291 hypothetical protein Ctob_011767（KOO26762.1）、藍(lán)隱藻（Guillardia theta CCMP2712） hypothetical protein GUITHDRAFT_137315 （XP_005834512.1）、綠藻屬Raphidocelis subcapitata hypothetical protein Rsub_10233(GBF97878.1) 、圓柱擬脆桿藻（Fragilariopsis cylindrus CCMP1102）FcCPD2（OEU23746.1），這五條氨基酸序列與Cry1-like氨基酸序列同源性分別為61.83%、58.90%、56.15%、53.11%、43.87%。此外， 球等鞭金藻Cry1-like與近緣物種海洋球石藻CRY1的氨基酸序列相似性高達(dá)95%。采用Clustalx軟件進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析，比對(duì)結(jié)果經(jīng)DNAman軟件優(yōu)化處理。結(jié)果顯示，球等鞭金藻Cry1-like氨基酸序列與上述幾個(gè)微藻隱花色素基因的氨基酸序列明顯存在多處保守區(qū)域。

2.4.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

從NCBI上數(shù)據(jù)庫(kù)中下載模式植物擬南芥、模式微藻三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum CCAP）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和金駝球藻（Ostreococcus tauri），以及海洋球石藻等物種隱花色素基因氨基酸序列，與球等鞭金藻Cryl-like基因氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)后采用最大似然法（Maximum likelihood）法構(gòu)建進(jìn)化樹（圖10）。從進(jìn)化樹上看，Cryl-like基因與海洋球石藻Cry1，金駝球藻CPD1，小球藻CPD1，擬南芥Cry1和Cry2處于同一分支上，序列之間親緣關(guān)系最為接近，進(jìn)一步證實(shí)Cryl-like基因是球等鞭金藻的Cry1基因。

3 小結(jié)與討論

本研究從課題組最新構(gòu)建好的球等鞭金藻基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中查找出Cryl-like基因，通過分子生物學(xué)方法克隆出球等鞭金藻隱花色素Cryl-like基因DNA和cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)其采用了理化性質(zhì)分析、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)、二三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、同源序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建等多種生物信息學(xué)手段進(jìn)行分析。通過分析，得知該基因DNA全長(zhǎng)2916 bp、cDNA全長(zhǎng)為2613 bp，編碼771個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為8.95，預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子量為85437.75 Da，且為不穩(wěn)定蛋白。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)蛋白結(jié)構(gòu)域含有隱花色素基因家族都有的2個(gè)結(jié)構(gòu)域：DNA光裂解酶結(jié)構(gòu)域、FAD結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，初步證實(shí)Cryl-like基因?qū)儆谇虻缺藿鹪咫[花色素基因家族成員。氨基酸序列同源性比對(duì)及序列進(jìn)化分析，Cryl-like基因與近緣物種海洋球石藻中的Cry1基因最為相似，并且球等鞭金藻與海洋球石藻都屬于金藻成員，因此預(yù)測(cè)Cryl-like基因是球等鞭金藻中的Cry1基因。

近年來，光信號(hào)引發(fā)的微藻光響應(yīng)機(jī)制成為微藻光生物學(xué)研究領(lǐng)域熱點(diǎn)。真核微藻中藍(lán)光受體基因克隆、蛋白結(jié)構(gòu)、分子進(jìn)化、光化學(xué)特性、生理功能及光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面研究不斷開展，取得了許多新的突破性進(jìn)展[13，14]。目前研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物隱花色素、植物隱花色素和DASH隱花色素三類隱花色素在綠藻、紅藻、硅藻等微藻中均廣泛存在。球等鞭金藻作為常見的海洋微藻，富含EPA、DHA和類胡蘿卜素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[15]，這些代謝物質(zhì)生成積累與球等鞭金藻光響應(yīng)機(jī)制發(fā)揮作用密不可分，而隱花色素在其過程中能起何作用和其中的機(jī)制原理都值得深入研究。本實(shí)驗(yàn)克隆得到球等鞭金藻Cryl-like基因，為后續(xù)隱花色素基因家族結(jié)構(gòu)與功能及其對(duì)藍(lán)光光響應(yīng)機(jī)制研究提供了依據(jù)。