EZH2在強直性脊柱炎患者中的表達及與Th17分化的關系

張岱陽，李 拓2*，羅 政，尹 銳，胡 睿

(恩施土家族、苗族自治州中心醫院 1.脊柱外科，2.眼科，湖北 恩施 445000)

強直性脊柱炎是一種主要侵犯脊柱、累及骰骼關節的慢性自身免疫炎癥性疾病，以骶髂關節和脊柱附著點、中軸骨骼炎癥為主要癥狀，患者致殘率高，對生活質量造成嚴重影響[1-2]。該病發病隱匿，病因較為復雜，多認為與遺傳、感染、免疫、炎性細胞浸潤、細胞因子失衡等因素相關[3]。研究表明[4]Th17可參與調控機體免疫平衡且在多種自身免疫疾病發生及進展過程中起重要作用。果蠅Zesle基因增強子2(enhancer of zesle homolog2，EZH2)是一種重要的組蛋白甲基化轉移酶，其可催化組蛋白H3上27位的賴氨酸三甲基化(H3K27me3)而抑制靶基因表達[5]。研究發現[6]EZH2介導的H3K27me3在輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)分化過程中扮演重要角色。但EZH2在強直性脊柱炎患者中的表達及與Th17分化的關系尚不清楚。本研究通過檢測EZH2在強直性脊柱炎患者外周血中表達水平并探討其與Th17分化的關系，以期為強直性脊柱炎的防治提供新的方向，現將研究結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年6月至2019年6月本院收治的強直性脊柱炎患者84例為病例組，男46例，女38例；年齡22～70歲，平均年齡(36.27±5.56)歲；病程1～8年，平均病程(3.61±1.70)年。納入標準：①符合強直性脊柱炎診斷標準[1]；②無脊柱炎病史或認知功能障礙；③入院資料齊全；④心、肝、腎、肺功能正常；⑤所有入選者對本研究內容知情同意。排除標準：①合并惡性腫瘤或先天性心臟瓣膜發育異常；②合并過敏性疾病或自身免疫性疾病；③納入研究前3個月進行過免疫調節治療；④妊娠期、哺乳期女性；⑤合并其他風濕性疾病；⑥合并心腦血管疾病。另選同期在本院健康體檢者50例為對照組，男27例，女13例；年齡21～68歲，平均年齡(35.12±5.68)歲。兩組年齡、性別等基線資料比較，差異無顯著性(P>0.05)(表1)。研究過程遵循人體試驗委員會制定的倫理學標準。

表1 兩組基線資料

1.2 研究方法

1.2.1 外周血單個核細胞中EZH2 mRNA水平 采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(Real time fluorescence quantitative-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)檢測，方法如下：采集兩組受試者空腹外周靜脈血2 mL，置于EDTA抗凝管(山東奧賽特醫療器械有限公司)中，采用人淋巴細胞分離液(北京冬璞泰和科技有限責任公司)分離外周血單個核細胞，采用總RNA提取試劑盒(上海玉博生物科技有限公司)提取總RNA，總RNA按照逆轉錄試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)操作步驟合成cDNA，以此cDNA為模板行PCR擴增，根據擴增曲線讀取循環數(Ct)，基因的相對表達量=2-△△Ct。

1.2.2 Th17細胞比率測定 采用流式細胞術檢測，方法如下：采集兩組受試者空腹外周靜脈血2 mL，置于肝素鈉抗凝管中，分離并提純外周血單個核細胞，將其接種于6孔板中(1×106/mL)，加入佛波醇乙酯(北京依托華茂生物科技有限公司)25 ng/mL 2 μL，離子霉素(上海聯碩生物科技有限公司)1 μg/mL 10 μL，放入37 ℃無菌細胞培養箱(德國Binder公司)中培養1 h，向培養箱中加入1 μL高爾基阻斷劑(上海懋康生物科技有限公司)培養6 h后收集細胞，采用5 μL IL-17A PE(蘇州派普泰克生物科技有限公司)標記Th17細胞，采用NovoCyte流式細胞儀(杭州艾森生物有限公司)檢測Th17細胞百分率，檢測結果以陽性細胞百分數表示。

1.2.3 檢測方法 血清白細胞介素1(Interleukin 1，IL-1)、轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、IL-17、IL-23水平：采用酶聯免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測，方法如下：采集兩組受試者空腹外周靜脈血2 mL，3 000 r/min離心15 min，分離血清，采用IL-6檢測試劑盒(武漢默沙克生物科技公司)測定血清IL-6水平，采用IL-17檢測試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)測定血清IL-17水平，采用IL-23檢測試劑盒(上海信然生物技術有限公司)測定血清IL-23水平，采用TGF-β檢測試劑盒(上海博湖生物科技發展有限公司)測定血清TGF-β水平。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 兩組外周血單個核細胞中EZH2 mRNA水平

病例組外周血單個核細胞中EZH2 mRNA水平明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 兩組外周血單個核細胞中EZH2 mRNA水平

2.2 兩組Th17細胞比率

病例組Th17細胞比率明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05，表3)。

表3 兩組Th17細胞比率

2.3 兩組Th17相關細胞因子水平

病例組血清IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β水平明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05，表4)。

表4 兩組Th17相關細胞因子水平 (pg/mL)

2.4 強直性脊柱炎患者外周血中EZH2與Th17、IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β的相關性

強直性脊柱炎患者外周血中EZH2分別與Th17、IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β呈正相關(P<0.05，表5)。

表5 EZH2與Th17、IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β的相關性

3 討 論

強直性脊柱炎(spondylitis ankylosans，AS)是一種自身免疫性疾病，其特征是炎癥高度活動和低度活動相互交替[7]。研究認為[8]該病的發生與Th17細胞免疫功能異常有關。Th17是由TH0細胞在TGF-β、IL-6、IL-23等刺激誘導下分化而成的輔助性T細胞，IL-17為其最主要的分泌產物，參與機體防御調節[9]。本研究顯示病例組外周血中Th17細胞比率、TGF-β、IL-6、IL-23高于對照組，提示AS發生可能與Th17細胞分化有關。其原因可能是Th17激活免疫細胞產生細胞黏附分子，促進血管上皮細胞分泌IL-17、IL-22等炎癥因子，引導炎癥反應。TGF-β、IL-6、IL-23作為誘導Th17細胞分化的關鍵性細胞因子，在炎癥加劇時其分泌也大量增加[10]。

近年來表觀遺傳學已被報道在免疫應答過程中發揮作用[11]。組蛋白甲基化修飾是表觀遺傳的調控方式之一，其修飾功能主要依賴于組蛋白甲基化轉移酶[12]。EZH2是一種重要的組蛋白甲基化轉移酶，也是多梳抑制復合體2的催化亞基，能夠催化H3K27me3，使得染色質抑制蛋白復合體在靶基因特定位點募集，從而抑制靶基因表達[13]。EZH2與H3K27me3能夠抑制Treg細胞分化[14]，并能夠直接結合Th2細胞分化的關鍵轉錄因子Gata3和Th1細胞分化的關鍵轉錄因子Tbx21的特定位點抑制2個基因表達，從而抑制CD4+T細胞向Th1、Th2細胞分化[15]。本研究顯示病例組外周血單個核細胞中EZH2 mRNA水平高于對照組，提示EZH2在AS患者外周血中呈高表達。有研究發現EZH2介導的H3K27me3與Th17分化過程密切相關，這與本研究相符，本研究顯示AS患者外周血中EZH2與Th17、IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β均呈正相關，提示EZH2與Th17分化相關，EZH2可能通過刺激Th17細胞分化，促進自身抗體形成，參與AS發生發展。

綜上所述，EZH2在AS患者外周血中呈高表達且與Th17分化呈正相關。EZH2可能通過刺激Th17細胞分化，參與AS發生發展，這可能為AS的免疫治療提供新的靶點和途徑。本研究為單中心研究，樣本量較少，僅對入院時AS患者外周血中EZH2、Th17、IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β水平進行了探討，缺乏動態觀察，仍需擴大樣本量進一步研究。