節律基因clif單核苷酸多態性與老年急性心肌梗死患者的相關性研究

呂煒俊，王云鄉，應婕

（永康市第一人民醫院 心內科，浙江 永康 321300）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死，多表現為胸骨后疼痛，可并發心律失常、休克等，常危及生命[1]。單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism, SNP）是指單個核苷酸變異所導致DNA序列多態性，有研究表明AMI 與易感基因SNP 密切相關[2-3]。許多心血管疾病的發作一般都會發生在某一特定時間段，比如AMI 多半在早晨突發，呈現較明顯的生物節律性。節律基因包括clock、period 和clif等，相關研究表明心血管疾病發生可能與節律基因突變或表達異常存在關聯[4]。絕大多數AMI 發生是由于冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或內皮損傷，凝血系統被激活，促使血栓形成，血管內皮損傷在AMI 發生過程中發揮重要作用。凝血酶調節蛋白（Thrombomodulin, TM）是一種具有清除凝血酶、活化抗凝因子的糖蛋白，可在抗凝因子蛋白C 協同作用下減少血栓的形成，是血管內皮細胞活化標志物，是反映血管內皮損傷的較敏感指標之一[5]。纖溶酶原激活抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）是一種與血漿波基結合素結合形成穩定復合物發揮活性的單鏈糖蛋白，可降低凝血及血栓形成[6]。為進一步明確節律基因在AMI 中發揮的作用及機制，本研究以老年AMI 患者為研究對象，以探討節律基因clif 單核苷酸多態性與該病的相關性，clif 與PAI-1、TM等鐘控基因的關系，為臨床防治AMI 及尋找新的早期預警指標提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2016年7月—2018年3月永康市第一人民醫院收治的、符合《急性心肌梗死診斷和治療指南》[7]、《2016年中國成人血脂異常防治指南》等[8]標準的126 例老年AMI 患者作為病例組。納入標準：意識清晰，無精神病史；無嚴重瓣膜病或心房顫動等；無嚴重凝血功能障礙或肝腎疾病；無腦梗死或惡性腫瘤者；依從性良好者等。排除標準：惡性腫瘤者；腦梗死者；心房顫動者；嚴重肝腎疾病者；周圍動脈栓塞者；依從性差者等。同期選取132 例健康體檢者作為對照組。研究經本院醫學倫理委員會審查通過。所有研究對象均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 動物及試劑

C57BL/6J 小鼠（由南京大學模式動物研究所提供），clif 基因慢病毒干擾試劑盒（中國上海吉瑪公司），Trizol 試劑盒（美國Invitrogen 公司），SNaP shot 試劑盒（美國ABI 公司），血漿PAI-1 和TM 酶聯免疫吸附試驗試劑盒（美國Sigma 公司），DNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRTPCR）試劑盒（日本TaKaRa 公司），PCR 擴增引物[生工生物工程（上海）股份有限公司設計、合成]，熒光定量PCR 儀（美國羅氏公司）、電泳儀及凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司），Nano Drop 2000c 紫外分光光度計（美國Thermo Scientific 公司）。

1.3 實驗方法

所有研究對象空腹采外周血5 ml，利用酚-氯仿有機油提法提取外周血細胞DNA，根據NCBI PubMed等篩選節律基因clif 位點，選擇標準為人群（漢族）具有較高頻率（MAF ≥0.05）、各位點間連鎖平衡r2≥0.8，再結合文獻，最終挑選rs2583913 和rs1071592 2 個位點。采用單堿基引物延伸法（SNaP shot 法）檢測多態性位點rs2583913 和rs1071592 在病例組和對照組中的SNP 基因型和等位基因頻率分布。

C57BL/6J 小鼠慢病毒轉染制備過程大致如下：構建clif 基因慢病毒干擾質粒，慢病毒組轉染間充質干細胞后，輸注到C57BL/6J 小鼠體內，作為慢病毒轉染組。慢病毒對照組的制備方法同慢病毒轉染組，輸注空白質粒。空白對照組輸注生理鹽水。每組15 只C57BL/6J 小 鼠 采 用qRT-PCR 檢 測 其PAI-1 及TM mRNA 的表達水平；運用ELISA 檢測干擾前后小鼠血漿中PAI-1、TM 及clif 表達量的變化。基因引物序列見表1。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以構成比或率（%）表示，比較采用χ2檢驗；采用Hardy-Weinberg 平衡檢驗計算基因頻率分布差異程度；采用基因計數法分析基因頻率及基因型分布頻率。P＜0.05 為差異有統計學意義。

表1 基因引物序列

2 結果

2.1 兩組研究對象的基線資料比較

兩組研究對象的性別、吸煙史、飲酒史、糖尿病史、高血壓史、年齡、收縮壓、血小板、甘油三酯、高密度脂蛋白及總膽固醇比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；兩組舒張壓、心率、白細胞計數、低密度脂蛋白、空腹血糖及肌鈣蛋白比較，差異有統計學意義（P＜0.05），病例組高于對照組。見表2。

2.2 兩組clif 基因多態性位點基因型及等位基因頻率分布情況

經Hardy-Weinberg 平衡檢驗，發現各基因型分布頻率達到遺傳平衡（P＞0.05）；兩組rs2583913 基因型及等位基因頻率分布情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；兩組rs1071592 基因型及等位基因頻率分布情況比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.3 慢病毒干擾沉默clif 后，小鼠血漿clif、PAI-1和TM mRNA 表達情況

慢病毒轉染組均轉染成功。以空白對照組小鼠clif、PAI-1 及TM mRNA 表達量為1.0 作為參照，慢病毒對照組小鼠clif、PAI-1 及TM mRNA 相對表達量分別為（0.9±0.1）、（0.9±0.1）及（0.9±0.1），差異無統計學意義（P＞0.05）；慢病毒轉染組小鼠clif、PAI-1 及TM mRNA 相對表達量分別為（0.2±0.1）、（0.4±0.2）及（0.6±0.1），均低于空白對照組及慢病毒對照組（P＜0.05）。見圖1。

表2 兩組患者的基線資料比較

表3 兩組clif 基因各位點基因型及等位基因頻率分布情況 例（%）

2.4 慢病毒干擾沉默clif 后，小鼠血漿中TM 和PAI-1 蛋白水平表達

各組小鼠血漿TM 和PAI-1 蛋白表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；慢病毒對照組和空白對照組血漿中TM 和PAI-1 蛋白表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；慢病毒轉染組血漿TM、PAI-1 蛋白表達量均低于空白對照組及慢病毒對照組（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠血漿TM 和PAI-1 蛋白表達量比較（n =15，±s）

表4 各組小鼠血漿TM 和PAI-1 蛋白表達量比較（n =15，±s）

注：?與空白對照組或慢病毒對照組比較，P ＜0.05。

組別 TM PAI-1空白對照組 49.2±12.3 22.6±5.1慢病毒對照組 47.6±11.5 21.8±4.8慢病毒轉染組 39.2±7.4? 17.6±3.3?F 值 3.838 5.415 P 值 0.029 0.008

3 討論

AMI 是由于冠狀動脈內血栓形成而引起，導致凝血及纖溶系統功能紊亂，及時抗凝治療可以有效減少心肌壞死面積，改善預后[9]。時間生物學研究發現，AMI大部分發生于早晨，中樞生物節律以及外周生物鐘紊亂，會增加心血管疾病的發生，節律基因與AMI 發病密切相關[10-11]。在大多數心血管疾病的病理過程中，存在有生物節律基因和相應的鐘控基因的異常表達，而該基因在疾病的病理過程中發揮各自的作用[12-14]。一般情況下，近日節律基因變化情況可以反映心血管系統是否正常。

本研究發現，病例組與對照組clif rs1071592 位點基因型及等位基因頻率分布情況均有差異，rs2583913位點基因型及等位基因頻率分布情況均無差異。表明clif 基因多態性位點rs1071592 與AMI 存在一定相關性。TM 與PAI-1 在機體凝血及血栓形成中扮演重要角色，當TM與PAI-1基因表達異常時，機體血凝及抗血栓功能均將失調。相關研究發現，TM及PAI-1基因表達下調，機體血凝及抗血栓功能減弱，易導致血管中形成血栓[15]。PAI-1作為鐘控基因產物之一，正常情況下表現出近日節律。相關研究表明，clock突變小鼠的纖溶活性較低，且PAI-1無近日節律[16]。表明，clock基因通過調控PAI-1來影響機體纖溶系統，進而對凝血系統產生影響。為此，本研究基于上述結論，推測clif 對PAI-1可能存在類似的調控機制。為進一步驗證這一推測，本研究結果發現，慢病毒轉染組clif、PAI-1 及TM mRNA 表達水平均低于空白對照組及慢病毒對照組。另外，慢病毒轉染組血漿TM、PAI-1 蛋白表達水平均低于空白對照組及慢病毒對照組。表明clif 基因變異可導致TM、PAI-1等鐘控基因的節律消失，易導致血管中血栓的形成。

綜上所述，節律基因clif 單核苷酸多態性位點rs1071592 與老年AMI 患者存在相關性。節律基因clif 表達可降低慢病毒干擾小鼠的PAI-1 及TM 表達水平，增加血栓形成風險。本研究為節律基因在AMI中的作用及機制提供重要實驗依據。