乙型肝炎患者胎盤組織中GSK-3β表達與HBV母嬰傳播的關系

宋文婷

（中國醫科大學附屬盛京醫院，遼寧 沈陽 110001）

我國是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）攜帶者的高發國家，其中母嬰傳播是慢性HBV 感染的主要原因，約占30%[1]。約90%圍生期感染HBV 者及約30%嬰幼兒時期HBV 感染者可發展成慢性感染，最終可進展為肝硬化、肝癌，嚴重影響兒童正常生長發育及威脅生命健康[2]。近幾年來臨床采取聯合注射乙型肝炎（以下簡稱乙肝）免疫球蛋白及乙肝疫苗的方法在阻斷HBV 母嬰傳播方面獲得較大成功，但仍有近20%左右的嬰兒因出生時已宮內感染HBV 而導致免疫失敗[3]。有研究顯示[4]，胎盤組織感染和宮內感染關系密切。HBV 可通過感染胎盤滋養層細胞而逐步滲透，最終感染胎兒。糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）在調節細胞周期、細胞凋亡及炎癥反應中具有重要作用，其作為磷脂酰肌醇3-激酶/（絲氨酸/蘇氨酸）（PI3K/Akt）信號通路的下游蛋白，可通過正、負反饋調節控制PI3K/Akt 生物活性，有研究表明[5]，乙肝病毒X 蛋白高表達可通過調控GSK-3β 表達而促進肝癌細胞的遷移。但目前關于胎盤組織中GSK-3β 表達與母嬰傳播關系的報道尚少，本研究檢測乙肝孕婦與正常孕婦胎盤組織中GSK-3β 表達情況，并分析其與HBV 母嬰傳播的關系，為臨床預防提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年4月—2018年1月在中國醫科大學附屬盛京醫院定期產檢及分娩的乙肝孕婦189 例（研究組），另選取正常孕婦106 例（對照組）。其中研究組年齡23 ～37 歲，平均（29.45±3.17）歲；孕32 ～40 周，平均（36.87±2.11）周；單胎。對照組年齡22 ～38 歲，平均（29.39±3.21）歲；孕30 ～41 周，平均（36.94±2.25）周；單胎。兩組年齡及孕周比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。納入標準：①研究組符合乙肝診斷標準[6]，孕期無抗病毒治療史。對照組正常妊娠；②兩組孕婦孕周＞28 周，且孕28 周前經B超檢查胎兒發育正常；③配偶為非乙肝；④均簽署知情同意書。排除標準：①血清甲、丙、戊型等肝炎病毒及人類免疫缺陷病毒陽性者；②伴有梅毒、單純皰疹病毒感染陽性者；③伴有脂肪肝、藥物性肝炎、免疫性肝炎者；④有先兆流產史者；⑤伴有妊娠期糖尿病、高血壓、腎病等其他內科疾病者。研究獲本院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑及儀器 HBV-DNA 定量檢測試劑盒購自上海申友生物技術有限公司，GSK-3β 兔抗人多克隆抗體購自美國Cell Signaling 公司，羊抗兔二抗抗體及DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，顯微鏡購自北京上光儀器有限公司。

1.2.2 外周血HBV-DNA 定量檢測 產前抽取研究組孕婦肘靜脈血5 ml，離心分離血清，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）對HBV-DNA 進行檢測，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作。

1.2.3 胎 盤 組 織GSK-3β 表 達 檢 測 于 孕 婦胎盤娩出后30 min 內留取全層胎盤組織大小約1.0 cm×1.0 cm×1.5 cm，置入10%甲醛溶液中浸泡固定后石蠟包埋，并4 μm 切片備用，采用免疫組織化學染色檢測胎盤組織GSK-3β 表達情況；另通過攝像機將所測目標的各種信息轉換成數字圖像，并傳遞至計算機系統（全自動彩色圖像分析系統），標定組織片的空白處射光的吸光度值，在監視器上使用不同的分割方法及編輯功能計算GSK-3β 陽性細胞平均吸光度值（每張切片觀察10 個視野）。

1.2.4 新生兒血清乙肝5 項（乙肝兩對半）檢測 于新生兒出生后24 h 內采集股靜脈血4 ml，離心分離血清，采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙肝病毒表面抗體（HBsAb）、乙肝病毒e 抗原（HBeAg）、乙肝病毒e 抗體（HBeAb）、乙肝病毒核心抗體（HBcAb）表達情況，試劑盒購自廣東中山生物有限公司，結果運用陽性（+）、陰性（-）表示；此外，并采用qRT-PCR 法對HBV-DNA 進行檢測（試劑盒及操作步驟同上）。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 研究組與對照組胎盤組織GSK-3β 表達及吸光度值 胎盤組織中以細胞核或胞內有棕黃色顆粒定為GSK-3β 陽性表達，將＜10%細胞核或胞內染色歸入為陰性（-），≥10%細胞核或胞內染色歸入為陽性（+），并分析GSK-3β 吸光度值。

1.3.2 研究組不同HBV-DNA 滴度胎盤組織GSK-3β 表達及吸光度值 將HBV-DNA 滴度分為＞1×102copy/ml 與≤1×102copy/ml 兩類，比較胎盤組織GSK-3β 表達及吸光度值。

1.3.3 研究組新生兒HBV 感染發生情況 新生兒外周血HBsAg 陽性和/或HBV-DNA 陽性定為HBV 感染存在，并根據感染情況將研究組所有新生兒分為感染組與未感染組，檢測感染組與未感染組母體胎盤組織GSK-3β 表達及吸光度值。

1.3.4 胎盤組織GSK-3β 表達與研究組新生兒HBV感染的關系 采用Logistic 多元逐步回歸模型進行分析，將孕婦年齡、血清HBV-DNA 載量、血清HBeAg表達及胎盤組織GSK-3β 表達設為自變量，其中孕婦年齡＜35 歲、血清HBV-DNA 載量≤1×102copy/ml、血清HBeAg 陰性及胎盤組織GSK-3β 陰性表達均賦值為0，將孕婦年齡≥35 歲、血清HBV-DNA 載量＞1×102copy/ml、孕婦血清HBeAg 陽性及胎盤組織GSK-3β 陽性表達均賦值為1；另將新生兒HBV 感染設為因變量，未發生感染賦值為0，發生感染賦值為1，進行多因素分析。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 23.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗，采用Logistic多元逐步回歸模型分析胎盤組織GSK-3β 表達與新生兒HBV 感染的關系，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組胎盤組織GSK-3β 陽性表達及吸光度值比較

研究組胎盤組織中GSK-3β 陽性表達及GSK-3β 吸光度值與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），研究組高于對照組。見表1。

2.2 研究組不同HBV-DNA 滴度胎盤組織GSK-3β 陽性表達及吸光度值比較

HBV-DNA 滴度＞1×102copy/ml 孕婦胎盤組織中GSK-3β 陽性表達及GSK-3β 吸光度值與HBV-DNA滴度≤1×102copy/ml 孕婦比較，差異有統計學意義（P＜0.05），HBV-DNA 滴度＞1×102copy/ml 孕婦高于HBVDNA ≤1×102copy/ml 孕婦。見表2。

2.3 研究組新生兒HBV 感染發生情況

研究組189 例新生兒中有19 例發生HBV 感染，新生兒HBV 感染率為10.05%（19/189），余170 例新生兒未發生HBV 感染。

表1 兩組胎盤組織GSK-3β 陽性表達及吸光度值比較

2.4 感染組與未感染組母體胎盤組織GSK-3β陽性表達及吸光度值比較

感染組母體胎盤組織中GSK-3β 陽性表達及GSK-3β 吸光度值與未感染組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），感染組高于未感染組。見表3。

表2 研究組不同HBV-DNA 滴度胎盤組織GSK-3β 陽性表達及吸光度值比較

2.5 胎盤組織GSK-3β 表達與新生兒HBV 感染的關系

經Logistic 多元逐步回歸模型分析，乙肝孕婦血清HBV-DNA 載 量＞1×102copy/ml、血 清HBeAg 陽性及胎盤組織GSK-3β 陽性表達均為新生兒HBV 感染的危險因素（=1.956、1.978 和1.931，P＜0.05）。見表4。

表3 感染組與未感染組母體胎盤組織GSK-3β 陽性表達及吸光度值比較

表4 新生兒HBV 感染影響因素的Logistic 回歸分析參數

3 討論

孕齡婦女HBV 感染率同一般人群相當，孕婦感染HBV 后可將HBV 傳播給胎兒，嚴重影響嬰兒健康[7]。宮內感染是HBV 母嬰傳播的重要途徑，其主要通過胎盤組織感染胎兒。在妊娠早期，母體抵抗力相對較強，HBV 很少通過胎盤組織感染胎兒，而妊娠晚期隨著胎盤面積的增大，胎盤的通透性漸漸增強，則胎兒HBV感染概率增加[8]。因此，需積極尋求有效控制HBV 宮內感染的方法。

本研究結果發現，研究組胎盤組織中GSK-3β陽性表達及GSK-3β 吸光度值較對照組高，HBVDNA 滴度＞1×102copy/ml 孕婦胎盤組織GSK-3β 陽性表達及GSK-3β 吸光度值較HBV-DNA 滴度≤1×102copy/ml孕婦高，提示乙肝患者胎盤組織中GSK-3β表達升高，且隨著血清HBV-DNA 滴度的升高，GSK-3β 表達呈升高趨勢。GSK-3β 普遍存在于真核生物中，屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有調節物質代謝及細胞生長的作用，其位于經典PI3K/Akt 信號通路的下游[9]。有研究顯示[10]，HBV X 蛋白可促進肝細胞株L02 細胞中GSK-3β 活性升高。另有研究顯示[11]，HBV 感染胎盤組織中GSK-3β 陽性表達高于正常胎盤組織，與本研究結果相符。另有相關研究顯示[12-13]，HBsAg 可通過多種方式激活PI3K/Akt 信號通路，且GSK-3β 在HBV 感染胎盤細胞中高度活化。孕晚期胎盤的通透性增強，HBV 較易通過胎盤，胎盤組織中HBsAg 呈現陽性，因HBsAg 可上調GSK-3β 活性，且促進GSK-3β 表達，則乙肝孕婦晚期胎盤組織中GSK-3β 表達較正常妊娠者升高[14]；另HBV-DNA 滴度越高，HBV 復制越活躍，則胎盤組織中HBsAg 活性越強，促使GSK-3β 表達升高[15]。

本研究結果發現，研究組189 例新生兒中有19例發生HBV 感染，新生兒HBV 感染率為10.05%，提示乙肝孕婦發生新生兒HBV 感染的概率較高，臨床醫療人員需加大重視，積極給予有效預防措施。另本研究結果還發現，感染組胎盤組織中GSK-3β 陽性表達率及GSK-3β 吸光度值較未感染組高，且經Logistic 多元逐步回歸模型分析，乙肝孕婦胎盤血清HBV-DNA 載 量＞1×102copy/ml、血 清HBeAg 陽 性及胎盤組織GSK-3β 陽性表達均是新生兒HBV 感染的危險因素，提示乙肝孕婦血清HBV-DNA 高載量、HBeAg 陽性及胎盤組織GSK-3β 陽性表達均可增加新生兒HBV 感染發生風險。母親HBV 感染標志物HBeAg 及HBV-DNA 反應病毒高度復制，其與外周血病毒量呈正相關，因絨毛膜間隙充滿母體血液，則母體血中HBV 病毒可直接接觸胎盤細胞，增加宮內感染發生概率。有研究報道[16]，HBV 感染孕婦胎盤的合體滋養層細胞結節增多，并具有絨毛水腫、血管充血擴張、纖維素樣壞死灶增加等病理改變。另有研究顯示[17]，HBV 感染胎盤后，胎盤滋養層細胞凋亡可能是阻止HBV 感染宮內胎兒的保護性機制。GSK-3β 可通過自分泌旁分泌環而激活PI3K/Akt 通路，進而促進滋養細胞增殖及抑制凋亡[18]。根據上述研究分析，HBV 感染孕婦胎盤組織GSK-3β 高表達，對滋養層細胞凋亡的抑制作用增強，則滋養細胞凋亡減少，為HBV 復制及增殖提供場所，導致宮內感染的發生，增加新生兒HBV 感染風險[19-20]。

綜上所述，乙肝患者胎盤組織GSK-3β 表達升高，且孕婦外周血HBV-DNA 滴度越高，GSK-3β 活性越強，GSK-3β 高表達可提高HBV 母嬰傳播概率，臨床工作中可將GSK-3β 作為治療HBV 宮內感染的潛在靶點，是否可在不影響胎兒發育的前提下通過降低GSK-3β 活性而阻斷HBV 垂直傳播具有研究價值。