結腸鏡活檢組織DKK3基因甲基化檢測及其臨床價值

周陽貞

湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院檢驗科，湖北省襄陽市 441000

DKK3基因具有拮抗Wnt信號傳導通路功能，可調控細胞增殖分化，目前研究發現DKK3甲基化與多種腫瘤的發病機制密切相關，可作為其病情及預后評估的標志物，較傳統的腫瘤標記物具有更高的靈敏度及特異性[1-2]。研究發現結腸癌腫瘤組織中的DKK3表達顯著降低[3]，基于基因表達法則推測在結腸癌中DKK3甲基化表達可能處于沉默狀態。故以本科結腸癌患者為研究對象，取其結腸鏡活檢組織，評價DKK3甲基化在其病情及預后評價中的指導意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2011年1—12月于本科診治的結腸癌患者納入本研究(COC組)。納入標準：(1)經術后病理組織學和(或)結腸鏡檢查、血清CEA和CA199、盆腹腔增強CT確診為結腸癌；(2)預計生存≥3個月，KPS評分≥70分；(3)首次發現，未行治療，無結腸癌病史；(4)排除合并嚴重心、腦、肺疾病及其他腫瘤。將同期行結腸鏡檢查的正常人納入對照組(CON組)，兩組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 DKK3甲基化檢測 兩組均行結腸鏡檢查，COC組結腸癌患者取腫瘤組織，CON組正常人取正常組織，提取兩組研究組織基因DNA待后續檢測。取兩組結腸鏡活檢組織，以MSP法檢測DKK3甲基化，引物選擇ABI Methyl primer Express設計，表2為其引物序列。擴增循環條件：5min 95℃預變性，30s 95℃變性，30s 58℃退火，40s 72℃延伸，共行32個循環，循環最后一輪行5min 72℃延伸5min。

表2 MSP法檢測DKK3甲基化引物

2 結果

2.1 DKK3甲基化比較 COC組結腸鏡活檢組織DKK3甲基化45例，甲基化率為60.0%(45/75)，CON組結腸鏡活檢組織DKK3甲基化0例，甲基化率為0%，COC組結腸癌患者結腸鏡活檢組織DKK3甲基化率較CON組高(P<0.05)。

2.2 COC組發生DKK3甲基化相關性 在年齡、性別、出血、梗阻、病變部位、COC組病理類型與DKK3甲基化無相關性(均P>0.05)。在腫瘤最大徑、分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、Dukes分期和手術切除方面與DKK3甲基化均有相關性(均P<0.05)。姑息性手術、C+D期、腫瘤最大徑≥5cm、低+中分化、有遠處轉移、有淋巴結轉移患者DKK3甲基化率高于根治性手術、A+B期、腫瘤最大徑<5cm、高分化、無遠處轉移及無淋巴結轉移患者(均P<0.05)，見表3。

表3 COC組臨床病理與DKK3甲基化關系

2.3 DKK3甲基化與預后關系 45,15 DKK3甲基化患者R0切除率、5年生存率及總生存時間均低于未甲基化患者(P<0.05)，見表4。

表4 DKK3甲基化與未甲基化結腸癌患者預后對比

3 討論

越來越多的研究證實結腸癌的發生、發展及轉歸與表觀遺傳學關系密切。其中，盡管異常甲基化并不依賴DNA堿基序列改變，但其仍然是結腸癌發病機制及表觀遺傳學中的最常見發病因素。5’甲基化mCpG結構單獨或與甲基結合蛋白結合后可阻止啟動子結合轉錄因子干預RNA轉錄，致使基因表達沉默[4-5]。作為調控細胞增殖分化的信號通路，Wnt信號傳導通路異常激活可導致胞漿內變異β-catenin蛋白大量積聚于細胞核內，加快靶基因轉錄翻譯，誘導腫瘤細胞增殖。研究證明，Wnt信號傳導通路在多種腫瘤中異常存在，且與其病情及預后緊密相關[6-7]。DKK3為Wnt信號傳導通路拮抗因子，可拮抗Wnt與其受體結合后的復合物而抑制Wnt信號傳導通路，DKK3表達升高可抑制腫瘤細胞增殖，降低則喪失調控功能導致惡性腫瘤發生[8]。目前，DKK3功能異常的機制尚未完全明確，越來越多的研究證實DKK3存在甲基化調控的CpG島，為DKK3表觀遺傳學調控提供客觀基礎。進一步研究發現，DKK3啟動子甲基化異常是其基因表達異常的最常見機制，在越來越多的腫瘤中發現DKK3啟動子處于高甲基化狀態，且與病情嚴重程度及預后好壞密切相關[9-10]?；谀壳鞍l現，判斷結腸癌發病機制及預后與DKK3啟動子甲基化密切相關。本研究中，COC組結腸癌患者結腸鏡活檢組織DKK3甲基化45例，甲基化率為60.0%，CON組正常人結腸鏡活檢組織DKK3甲基化0例，甲基化率為0%，提示結腸癌發病機制與DKK3甲基化異常緊密相關。

本研究中，結腸癌患者結腸鏡活檢組織DKK3甲基化在分化程度、腫瘤最大徑、淋巴結轉移、遠處轉移、Dukes分期和手術切除方面均有差異。姑息性手術、C+D期、腫瘤最大徑≥5cm、低+中分化、有遠處轉移、有淋巴結轉移患者DKK3甲基化率高于根治性手術、A+B期、腫瘤最大徑<5cm、高分化、無遠處轉移及無淋巴結轉移患者。在R0切除率、總生存時間、5年生存率方面，COC組DKK3甲基化患者低于未甲基化患者，提示DKK3甲基化在結腸癌病情及預后評估中應用價值較高。目前，對于結腸癌及其預后評估多依據術后病理，但其僅可在術后才可獲得客觀證據，其對于無法獲得術后病理評價的遠處轉移患者則無任何價值，且手術后病理無法在術前為病情及預后提供證據[11-12]。實踐證明，結腸鏡活檢較術后病理檢查更加方便快捷，不但能于術前獲取客觀證據，對于無法手術患者也具有較高的臨床價值。和常規標志物相比較，DKK3甲基化建立基因水平之上，其靈敏度及特異性更高，相信隨著快速基因組測序，基因水平的標志物會更準確。