血清microRNA-122a、microRNA-124a及microRNA-125b對膿毒癥休克并發肝損傷早期診斷及預后評估的臨床價值*

桑珍珍，高杰，賈春梅，李勇

（滄州市中心醫院 急診科，河北 滄州 061001）

膿毒癥是由感染引起機體炎癥反應失控導致的危及生命的器官功能障礙[1]。急性肝損傷可發生在膿毒癥的任何階段，膿毒癥休克時肝臟微循環處于低灌注狀態，容易出現肝組織和細胞的損傷、缺血和壞死[2]。有研究報道，microRNA 在調控炎癥及肝功能方面發揮重要作用，但其對膿毒癥相關肝損傷的診斷效能及預后價值尚缺乏相關研究[3-4]。本研究通過檢測膿毒癥休克患者血清microRNA-122a（miR-122a）、microRNA-124a（miR-124a） 及microRNA-125b（miR-125b）的相對表達量，分析其對膿毒癥休克合并肝損傷早期診斷及預后評估的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年12月—2019年2月滄州市中心醫院急診重癥監護室（EICU）收治的254 例膿毒癥休克患者作為研究對象。患者年齡18～80 歲，病例資料完整。根據是否發生肝損傷將患者分為肝損傷組和無肝損傷組，分別有86 和168 例。肝損傷組再按肝損傷嚴重程度分為輕、中、重度肝損傷組，分別有20、25 和41 例。肝損傷組治療28 d 后根據生存情況分為存活組和死亡組，分別有26 和60 例。選取同期本院健康體檢者40 例作為對照組。患者均符合膿毒癥與膿毒性休克國際處理指南（2016 版）的診斷標準[1]：膿毒癥為感染后序貫器官衰竭估計（SOFA）評分≥2 分；膿毒性休克指膿毒癥患者經充分液體復蘇仍存在持續性低血壓，需要血管活性藥物維持平均動脈壓（mean arterial pressure,MAP）≥65 mmHg，血乳酸（Lac）水平＞2 mmol/L。肝損傷組患者同時符合膿毒癥相關肝損傷診斷標準[5]。排除標準：①既往有肝臟腫瘤、慢性肝臟疾病、梗阻性黃疸及慢性肝功能障礙急性發作入住EICU；②中毒或藥物性肝損傷等非膿毒癥原因引起的肝損傷；③年齡＜18 歲或＞80 歲；④病例資料完整性不能滿足研究要求。本研究符合倫理學標準，并經醫院倫理委員會批準，檢查和治療均獲得患者家屬的知情同意。

1.2 膿毒癥相關肝損傷診斷標準

血清谷丙轉氨酶（ALT）或直接膽紅素升高至正常值上限（normal upper limit,ULN）2 倍以上；或血清谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）和總膽紅素（TBIL）同時升高，且其中有≥1 項升高至ULN 的2 倍以上。ALT 升高定義為＞80 u/L，TBIL 升高定義為＞34.1μmol/L。輕度組：1＜ALT/ALTULN＜3或1＜TBIL/TBILULN＜2；中度組：3＜ALT/ALTULN＜5 或2＜TBIL/TBILULN＜3；重度組：ALT/ALTULN＞5 或TBIL/TBILULN＞3[5]。

1.3 觀察指標

記錄患者入EICU 當日的一般資料，包括年齡、性別、感染部位、心率（HR）、MAP、中心靜脈壓（central venous pressure,CVP）、去甲腎上腺素（NE）用量、Lac、氧合指數、血常規、生化指標、機械通氣、急性生理學和慢性健康狀況評估Ⅱ（APACHE Ⅱ）評分及SOFA 評分等，記錄患者治療28 d 后的預后。

1.4 標本采集與檢測

患者入院當天（治療前）采集患者肘靜脈血5 ml，3 000 r/min 離心10 min，取血漿于-80 ℃保存，待 測miR-122a、miR-124a 及miR-125b 相 對表達量。血清miRNA 提取及檢測：在miRBase 上查找目的基因序列，由美國Invitrogen 公司設計合成引物，提取血清miRNAs，合成cDNA。以U6 作為內參，在9700 型基因擴增儀中擴增miRNAs。RT-PCR 反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火60 s，共40 個循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-122a、miR-124a 及miR-125b 的相對表達量。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 23.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）或中位數和四分位數間距 M（P25，P75）表示，比較用t檢驗、方差分析、Mann-WhitneyU檢驗或H檢驗；計數資料以構成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic curve,ROC）曲線，采用二元Logistic 回歸法分析影響膿毒癥休克患者預后的危險因素，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組臨床資料比較

肝損傷組與無肝損傷組降鈣素原（PCT）、APACHE Ⅱ評分、SOFA 評分及治療28 d 后病死率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），肝損傷組高于無肝損傷組。見表1。

輕、中、重度肝損傷組治療前的APACHE Ⅱ評分、SOFA 評分、治療28 d 后病死率及PCT 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），重度肝損傷組高于輕、中度肝損傷組。見表2。

表1 各組臨床資料比較

續表1

表2 不同程度肝損傷組臨床資料比較

2.2 各組血清miR-122a、miR-124a、miR-125b 相對表達量比較

肝損傷組、無肝損傷組和對照組血清miR-122a、miR-124a 及miR-125b 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），肝損傷組、無肝損傷組高于對照組（P＜0.05）。見表3。

各組血清miR-122a、miR-124a 及miR-125b 相對表達量比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05），重度肝損傷組高于輕、中度肝損傷組（P＜0.05）。見表4。

血清miR-122a、miR-124a 及miR-125b 診斷膿毒癥休克合并肝損傷的AUC 分別為：0.796（95% CI：0.728，0.854）、0.771（95% CI：0.701，0.832）和0.784（95% CI：0.715，0.840）。當miR-122a 表達量最佳臨界值為2.80 時，其診斷膿毒癥休克合并肝損傷的敏感性為71.76%（95% CI：67.24%，76.50%），特異性為75.29%（95% CI：71.36%，79.48%）。當miR-124a 表達量最佳臨界值為2.56 時，其診斷膿毒癥休克合并肝損傷的敏感性為63.53%（95% CI：60.13%，67.52%），特異性為81.18%（95% CI：78.96%，85.47%）；當miR-125b 表達量最佳臨界值為2.59 時，其診斷膿毒癥休克合并肝損傷的敏感性為72.90%（95% CI：69.58%，78.65%），特異性為78.80%（95% CI：72.66%，83.73%）。見圖1。

表3 各組血清miR-122a、miR-124a、miR-125b 相對表達量比較 （±s）

表3 各組血清miR-122a、miR-124a、miR-125b 相對表達量比較 （±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與無肝損傷組比較，P ＜0.05。

組別 n miR-122a miR-124a miR-125b對照組 40 1.03±0.02 1.12±0.25 1.09±0.26無肝損傷組 168 2.55±0.45① 2.38±0.31① 2.24±0.22①肝損傷組 86 2.83±0.56①② 2.56±0.37①② 2.59±0.44①②F 值 18.735 17.328 9.506 P 值 0.000 0.000 0.001

表4 各組入院即刻血清miR-122a、miR-124a 及miR-125b 相對表達量比較 （±s）

表4 各組入院即刻血清miR-122a、miR-124a 及miR-125b 相對表達量比較 （±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與無肝損傷組比較，P ＜0.05；③與輕度肝損傷組比較，P ＜0.05；④與中度肝損傷組比較，P ＜0.05。

組別 n miR-122a miR-124a miR-125b對照組 40 1.03±0.02 1.12±0.25 1.09±0.26無肝損傷組 168 2.55±0.45① 2.38±0.31① 2.24±0.22①輕度肝損傷組 20 2.57±0.34①② 2.49±0.46①② 2.42±0.35①②中度肝損傷組 25 2.84±0.56①②③ 2.58±0.39①②③ 2.67±0.22①②③重度肝損傷組 41 3.54±0.58①②③④ 2.76±0.34①②③④ 2.85±0.42①②③④F 值 19.436 23.842 21.398 P 值 0.000 0.000 0.000

圖1 血清miR-122a、miR-124a 及miR-125b 診斷膿毒癥休克合并肝損傷的ROC 曲線

2.3 死亡組與存活組臨床資料比較

死亡組與存活組治療28 d 后APACHE Ⅱ評分、SOFA 評分、Lac、PCT、肝損傷嚴重程度，血清miR-122a、miR-124a 及miR-125b 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），死亡組高于存活組。見 表5。

2.4 膿毒癥休克合并肝損傷預后危險因素的Logistic 回歸分析

以肝損傷嚴重程度、APACHE Ⅱ評分、SOFA 評分、PCT、Lac、miR-122a、miR-124a 及miR-125b 作 為 自變量，膿毒癥休克合并肝損傷患者入院28 d 后是否死亡作為因變量（0 為否，1 為是）行二元Logistic 回歸分析。肝損傷嚴重程度、APACHE Ⅱ評分、SOFA 評分和miR-122a 是影響膿毒癥休克合并肝損傷患者預后的危險因素（P＜0.05）。見表6。

表5 死亡組與存活組臨床資料比較

表6 毒癥休克合并肝損傷預后危險因素的Logistic 回歸分析參數

3 討論

膿毒癥最新定義為感染的宿主反應失調引起的致命性器官功能障礙[1]。膿毒性休克為膿毒癥的一個亞組，具有較高的病死率，是ICU 患者主要死亡原因之一[6]。膿毒癥肝損傷的機制眾多，按發病機制不同可分為缺血缺氧性損傷、肝細胞性肝損傷和膽汁淤積性損傷[7]。膿毒癥休克引起的肝損傷主要為缺血缺氧性損傷，膿毒癥休克時肝臟微循環也處于低灌注狀態，肝竇內皮細胞功能的紊亂，中性粒細胞浸潤，肝組織細胞缺血和壞死[8]。

有研究報道，miR-122a 能抑制抗凋亡基Bcl-xL、Bcl-2表達，導致大量淋巴細胞凋亡，免疫功能抑制，膿毒癥后期感染難以控制[9]。有研究報道，在急性呼吸窘迫損傷綜合征患者中，血清miR-122a 相對表達量的升高與病死率和急性肝損傷有關[10]。本研究顯示，肝損傷組血清miR-122a 相對表達量顯著高于無肝損傷組，并隨肝損傷程度加重呈遞增趨勢；死亡組患者血清miR-122a 相對表達量顯著高于存活組，表明血清miR-122a 可用于膿毒癥休克合并肝損傷的早期診斷、嚴重程度和預后評估。

有研究報道，miR-124 參與炎癥、自身免疫性及肝臟疾病的發生、發展[11]。有研究報道，miR-124a 通過靶向作用于白細胞介素-11，抑制肝細胞增殖，促進肝細胞凋亡，為肝癌的診斷和臨床治療提供新的靶點[12]。miR-124-3p 在大鼠肝撞擊損傷模型中作為Beclin1 和LC3 表達的負調控因子，調節肝細胞自噬，減輕肝臟損傷[13]。miR-125 參與炎癥反應、免疫反應和缺血再灌注損傷、肝臟損傷等生理和病理過程[14-15]。在異煙肼誘導的肝損傷過程中，DNA 甲基化可能調控miR-125b 的表達，影響STAT-3 的表達，參與肝損傷過程[16]。在脂多糖誘導內皮細胞損傷的體外模型中，miR-125b 表達上調時可抑制TRAF6 介導的NF-κB激活，減弱細胞間黏附分子-1 和血管細胞黏附分子-1的表達；在膿毒癥小鼠模型中，減少心肌巨噬細胞和中性粒細胞的聚集，降低血清腫瘤壞死因子-α 和白細胞介素-1β 等炎癥因子，減輕膿毒癥引起的心功能障礙，提高生存率[17]。本研究顯示，肝損傷組血清miR-124a、miR-125b 相對表達量高于對照組，隨著miR-125b 相對表達量的升高，肝損傷程度逐漸加重，病死率逐漸升高，血清miR-125b 相對表達量對膿毒癥休克合并肝損傷的早期診斷具有臨床價值。

綜上所述，通過ROC 曲線分析發現miR-122a、miR-124a 及miR-125b 對膿毒癥休克合并肝損傷有早期診斷價值，提示可作為膿毒癥休克合并肝損傷的新型生物標志物。通過二元Logistic 回歸分析發現miR-122a 是影響膿毒癥休克患者預后的獨立危險因素。本研究尚有許多不足之處：miRNAs 表達量的測量應如何標準化以考慮個體或群體間的差異尚不清楚，需要在細胞、組織及動物水平作進一步深入研究。