拉曼光譜技術在乳腺癌臨床應用方面的研究進展

申李勝男,李思敏，李 倩，麻 帥，韓 冰

(吉林大學第一醫院乳腺外科，吉林 長春 130021)

2018年，世界衛生組織宣布有62.7萬女性死于乳腺癌，占女性因惡性腫瘤死亡人數的15%，全世界約有200萬新確診病例[1]。在過去的幾十年里，全球乳腺癌發病率持續增加，其中發達地區的發病率更高[2-4]。乳腺癌篩查通常采用影像學(鉬靶和超聲相結合)和體格檢查的方式，可疑為乳腺癌的患者需進行穿刺或切除活檢，其中70%～90%的患者在活檢中確診為良性，患者承受了不必要的創傷、巨大的精神壓力和高額的醫療費用[5-6]。乳腺癌保乳手術采用不同顏色染料標記切除病灶各個切緣，應用石蠟病理判斷切緣是否有病灶殘留，但該方法耗時長，無法在當次手術中確定切緣情況，導致保乳手術的二次手術率高達 17%，增加了患者身心痛苦和經濟負擔，因此急需一種無創、方便和即時的技術進行判斷。拉曼光譜具有無需樣品制備、對樣品無接觸、不破壞樣品結構、分析簡便快速和分辨率高等特點，因而可應用于疾病的預測、診斷及療效判斷。近年來，拉曼光譜檢測技術不斷完善，且統計學方法廣泛應用于拉曼光譜結果的分析，使探索應用腫瘤的拉曼光譜特點進行診斷成為新的研究熱點，目前國內外綜述內容主要集中于拉曼光譜技術在細胞和組織中的研究結果及光譜歸屬等方面，但拉曼光譜測量儀器以及拉曼光譜技術的改進、乳腺癌拉曼光譜臨床應用的相關綜述國內尚無報道。本文作者系統回顧了近年來拉曼光譜測量儀器以及拉曼光譜技術的變化，對拉曼光譜在乳腺癌細胞系和組織檢測的研究進展及其臨床意義以及拉曼光譜臨床應用時待解決的問題和未來的發展趨勢進行綜述。

1 乳腺癌臨床研究中拉曼光譜技術的進展

拉曼光譜檢測儀器與方法的改進促進了拉曼光譜技術在乳腺癌中的研究。最初的檢測方法是自發拉曼光譜(Raman spectroscopy)，當光被物質散射時，絕大部分光子會發生彈性散射，還有一小部分光子會與介質分子發生非彈性碰撞，散射光子與分子相互作用產生能量交換，這種現象稱為非彈性散射。拉曼散射效應最早由印度物理學家 RAMAN C.V.發現，激發光使用可見光或者近紅外光，降低了水的吸收，使得拉曼光譜可應用于體液或者液體環境下細胞的測量[7]。

但是生物樣本(組織、細胞和體液)的自發信號弱，檢測時間長，易受熒光干擾。1973年表面增強拉曼散射光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)首次在吸附于粗糙銀電極的吡啶上觀察到，與傳統的拉曼散射方法相比有幾個數量級的增強。SERS的增強機制目前認為主要有2種：第1種為電磁場增強機制,激發光刺激惰性貴金屬(金和銀等)納米顆粒產生等離子激元，等離子激元與拉曼活性分子相互作用，導致分子拉曼光譜信號增強105～1010倍[8]；第2種為化學增強機制,樣本表面分子與金屬表面的成鍵等相互作用，從而使分子拉曼光譜信號增強。雖然測量物質與增強劑不需要接觸就能發生SERS增強，但在1～30 nm范圍內SERS增強效應較強[9-11]，因此在術中檢測應用時應加入生物相容性較好的納米顆粒，檢測位點應盡量接近納米顆粒。

共振拉曼光譜(resonance Raman scattering, RRS)入射光頻率與分子電子躍遷頻率一致時相應分子的光譜增強102～106倍，當共振分子光譜增強時未共振光譜信息被湮滅，而無需加入任何樣本的預處理。即使在拉曼光譜信號復雜的樣品中，RRS只提供部分分子的信息，降低光譜的復雜性而便于識別。但RRS易受熒光背景的影響，應使用短波長的激發光加以避免，而短波長激發光容易造成組織損傷，不適合用于活體檢測。

移頻激發差分拉曼光譜(shifted-excitation Raman difference spectroscopy, SERDS)通過拉曼光譜和熒光光譜對激發光波長的依賴程度不同，有效解決了生物樣本檢測拉曼光譜時熒光干擾的困擾[12-13]，因此成為避免熒光干擾最常用的手段。在一定的范圍內，隨著激發波長的變化熒光光譜幾乎不會發生改變，而激發波長對拉曼光譜中熒光有很大影響。采用2個相近頻率的激發光照射樣品，對得到的2組光譜進行差分處理消除熒光的干擾，可得到只包含拉曼光譜信息的數據。SERDS檢測正常乳腺組織、纖維腺瘤和浸潤性乳腺癌，判斷是否含有病變組織的敏感度和特異度均達到100%[14]。相干拉曼散射(coherent Raman scattering, CRS)是一個典型的采用皮秒脈沖激光器的三維非線性過程，CRS通過相干激勵增強信號，可以大幅縮短數據采集時間。當泵振動和斯托克斯振動頻率與分子的振動頻率發生共振時，將有4種主要的CRS過程同時發生：相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-stokes Raman scattering spectrum,CARS)、相干斯托克斯拉曼散射(coherent stokes Raman scattering spectrum,CSRS)、受激拉曼增益(stimulated Raman gain,SRG)和受激拉曼損耗(stimulated Raman loss,SRL)。通常在 CARS 過程中還會伴有非共振的四波混頻信號，這種非共振背景將導致 CARS 光譜與自發拉曼光譜相比發生線型變化，使得 CARS 信號難以簡單地被解釋。而對于指紋區成像，由于 CARS 信號很容易被強大的非共振背景淹沒，如何減輕乃至消除非共振背景干擾也是 CARS 成像所面臨的一大挑戰[15]。與CARS比較，受激拉曼散射(stimulated Raman scattering,SRS)成像最大的優點在于沒有非共振的背景，其光譜線型與自發拉曼光譜完全一致，因而 SRS 信號的分配和解釋可以直接參考已經發表的拉曼光譜文獻。兩者均可以同時獲得整個激發態譜，實現了生物組織的成像，但是需要可調諧脈沖激光器探測樣品中的不同分子，因此很難將激光有效地耦合和同步到手持或便攜式術中設備中。

空間偏移拉曼光譜(spatial offset Raman spectroscopy,SORS)提供了一種對深部組織樣品進行非侵入性研究的方法[16-17]，其具有抑制表層成分拉曼光譜和熒光背景干擾的能力。光譜探測位置與激發光入射位置不同，當激光入射到樣本表面并透射入表層物質內部時，其中一部分散射光子經過多次散射后達到組織深層, 并與深層組織成分發生拉曼散射,攜帶深層組織物質信息的拉曼散射光子在探測位置進行分析[18]，目前已有研究[19-20]將SORS用于檢測假酒、評估骨成分以及分析乳腺癌組織中的微鈣化等方面。將羥磷灰石、單水草酸鈣以及 3.5% 碳酸鹽置入8.7 mm 厚的雞乳腺組織中，采用SORS檢測正常乳腺組織下的癌癥邊緣，證實了拉曼光譜檢測新鮮乳腺組織內微鈣化灶的可行性。最近一些科學家將SORS與SERS的優點相結合用來檢測深部樣本的拉曼信號，NICOLSON等[21]采用便攜式拉曼光譜儀檢測埋于組織中的三維乳腺腫瘤模型，結果表明其跟蹤乳腺腫瘤的深度達25 mm,為臨床應用奠定了理論基礎。

2 拉曼光譜在乳腺癌細胞系中的應用

乳腺癌很可能轉移到骨骼、中樞神經系統和內臟，導致預后不良和總體生存率降低[22-23]，因此通過乳腺癌的拉曼光譜特點早期發現乳腺癌可降低乳腺癌患者的病死率。研究者[24-25]運用拉曼光譜、原子力顯微鏡(AFM)、光學顯微鏡探索正常乳腺細胞系(MCF-10A)與乳腺癌細胞系(MDA-MB-231, MDA-MB-453)之間的差異與聯系，采用主成分分析法(principal component analysis,PCA)分析拉曼光譜，得出正常乳腺細胞系(MFC-10A)和乳腺癌細胞系(MDA-MB-231, MDA-MB-453)的拉曼光譜主要波峰為苯基丙氨酸帶、酰胺Ⅰ和Ⅲ帶、CH2變形、CH2擺動/扭轉和S-S鍵振動帶。在2種乳腺癌細胞系中，酰胺Ⅰ、CH2變形帶的強度類似，但是乳腺癌細胞系MDA-MB-231有較強的CH2變形帶，運用這些波峰特征可以有效地區分3種細胞系，為拉曼光譜診斷乳腺癌奠定基礎。

指導惡性腫瘤治療的2個重要指標是“腫瘤反應”和“疾病進展”。腫瘤反應是指在治療早期對治療效果進行評估，疾病進展為癌癥的增長和擴散，代表治療失敗。腫瘤進展包括多種機制，其中基質、血管生成、炎癥、免疫系統、激素和外源性生物制劑發揮著重要作用，所有這些機制均會引起組織生化水平的變化[26-28]，因此識別癌組織的生化變化可以評估腫瘤的轉移潛能、侵襲性和疾病進展，有助于制定治療決策。MARRO等[29]發現：乳腺癌細胞趨向性與氨基酸、線粒體信號水平降低有關。MIGNOLET等[30]在MCF-7細胞內發現了4種使胞內脂類增加的多酚，并且其與細胞凋亡有關。研究[31-32]顯示：乳腺癌的遠處轉移與細胞表面糖脂和糖蛋白的唾液酸化有關聯。ABRAMCZYK等[33]發現：隨著細胞侵襲性增加，細胞核仁組蛋白乙酰化水平升高；甲基伸縮振動隨著惡性程度增加，拉曼光譜發生藍移。放療是乳腺癌治療手段之一，研究者[34-35]采用拉曼光譜研究輻射對乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MCF-7的影響，結果表明：拉曼光譜可評估細胞內糖原水平的變化，將其用于惡性腫瘤潛在標志物和對放射治療耐藥機制的研究。研究者[36-37]采用拉曼光譜研究了乳腺癌耐藥性與HER-2基因過表達的關系，結果表明：拉帕替尼的耐藥性與HER-2基因過表達有關，在HER-2基因過表達的細胞中脂類增加，蛋白減少；接受拉帕替尼治療后，HER-2基因陽性的細胞中脂類仍在增加。在治療過程中，研究乳腺癌組織的拉曼光譜變化，可以確定治療方法是否有效、是否需要修改，并有助于確定臨床研究中進展終點的時間。

3 拉曼光譜在乳腺組織中的應用

拉曼光譜對乳腺癌組織的研究經歷了從體外到體內、從組織切片到新鮮組織的過程，正常乳腺腺體與病變乳腺組織拉曼光譜的差異主要集中在胡蘿卜素、脂質和蛋白質。乳腺良性與惡性病變拉曼光譜的主要差異為胡蘿卜素和脂肪酸，利用酰胺Ⅰ和CH2彎曲振動的比值作為鑒別參數，可以區分正常乳腺組織和惡性乳腺組織。惡性組織特點為脂類含量下降、核酸和蛋白增加及結構紊亂(分子氫鍵斷裂)。 研究[38-40]顯示：類胡蘿卜素的拉曼光譜是惡性腫瘤表現出的關鍵特征；癌前病變、導管內癌和浸潤性癌組織中，DNA 的磷酸骨架伸縮振動譜線的特征峰藍移至1 086 cm-1，說明在癌前病變組織中部分DNA 的單雙鏈斷裂。

正常乳腺組織與良、惡性病變組織的拉曼光譜特征為胡蘿卜素、脂類、核酸和蛋白質含量不同，但目前研究主要集中于組織切片，并且均未構建合適的模型區分正常組織、良性病變和惡性病變。HAKE等[41]在2002年采用共聚焦顯微拉曼光譜儀檢測了乳腺組織的冰凍切片，通過擬合來源于細胞質、細胞核仁、脂肪酸、膠原蛋白、羥磷灰石鈣、草酸鈣、脂質和水的光譜，構造形態/化學乳房組織模型；通過以上實驗構建的拉曼光譜脂質和膠原蛋白擬合系數，區分乳腺良、惡性病變的靈敏度為94%，特異度為96%。GEBREKIDAN等[14]構建的模型診斷乳腺癌的靈敏度為99.15%，非乳腺癌病變的特異度為90.4%，在含有惡性病變的組織內發現惡性成分的靈敏度為100%。但既往研究中實驗標本均進行了預處理，如冰凍、甲醛固定、石蠟包埋和脫蠟等，這些預處理會影響組織拉曼光譜信號，因此檢測未進行任何處理的新鮮在體組織的拉曼光譜非常必要。HAKA等[41]檢測了9例保乳術患者的手術切緣，利用之前構建的數據模型進行診斷，檢測陽性切緣的靈敏度為100%，特異度為100%，總準確率為93.3%。SHIPP等[42]探索多光譜組織病理學判斷保乳手術切緣的應用，多光譜組織病理學利用自發熒光顯微鏡高空間分辨率、速度、敏感性(低特異性)結合高化學特異性的拉曼光譜可發現微小腫瘤，靈敏度達91%，特異度達83%。證實了拉曼光譜在體內檢測可以實現，但是由于絕經前后乳腺組織脂肪含量變化和化療對乳腺組織的影響，仍然需要構建更成熟的模型，以乳腺組織拉曼光譜特征為標準構建模型，可快速、客觀、準確地鑒別乳腺癌組織、良性病變組織與正常組織。

保乳手術中準確地判斷陰性切緣并區分良、惡性組織非常重要。拉曼光譜可以提供組織的化學性質和疾病發展狀態等信息。在探索性手術中通過拉曼光譜判斷病變的性質，可以降低二次手術率。拉曼光譜可以提供與傳統病理類似的圖像，結合拉曼光譜的穿刺活檢技術可以提供即時、無需標記且客觀的化學信息。研究[43-46]顯示：利用建立的擬合系數模型，可成功地識別組織的良、惡性，在體內測量的準確率可達93.3%，光譜活檢穿刺測量為實時診斷奠定了基礎。

拉曼光譜技術不但可以應用于乳腺癌的診斷，還可以用于研究疾病進展及化學通路，為更好地理解疾病和治療疾病提供生化信息。研究[40,47]顯示：癌組織與正常組織中脂質構成比存在差異，對照脂質成分的拉曼光譜可以發現非癌組織的脂質多為油酸(油酸及其衍生物是脂肪組織中甘油的組成部分)，而癌組織中多為花生四烯酸(AA)(不飽和脂肪酸)。這一變化表明代謝是通過環氧合酶(COX)途徑進行，不是通過脂氧合酶(LOX)進行，而LOX會導致二十烷酸類化合物參與炎癥過程[48]。COX催化生成環狀化合物，LOX催化生成非環狀化合物。AA先于二十碳酸及其衍生物合成，其生物活性大于同型亞麻酸(DGLA)和二十碳五烯酸(EPA)。隨著組織惡性程度增加，OH-NH-CH的光譜增強，代表重要生物分子(如核酸、蛋白、脂肪)的增加，位于600～1 600 cm-1(與核酸有關)的拉曼波峰也會發生改變。這些波峰的改變有助于對乳腺癌進行分級分期，高級別導管原位癌的脂肪酸和甘油的拉曼光譜增加而低級別則減少[48]。

癌癥的具體病因并不明確，老化、氧化和自由基可能是其原因。BROZEK-PLUSKA等[38]對44例患者新鮮手術標本(腫瘤組織、健康組織和血管標本)進行分析，在獲得的321個光譜中發現正常乳腺組織中類胡蘿卜素和脂質的峰值明顯；但是惡性腫瘤組織熒光干擾較強。在惡性腫瘤中類胡蘿卜素和脂質峰值降低表明這些成分在惡性組織中的含量較低，類胡蘿卜素減少可能由于脂褐素氧化，而脂質減少也可能為脂質過氧化。

4 展 望

利用拉曼光譜分析生物樣本仍然存在很多挑戰與局限性。樣本的拉曼光譜信號較弱時可使用SERS等靈敏度較高的技術，但樣品制備起著重要的作用。在分析生物樣品的拉曼光譜時，由于成分復雜，需要建立可靠的校準模型確保可靠和定量測量。此外在使用探針進行體內分析時也存在挑戰，在引入拉曼光譜作為診斷依據之前，需要克服背景熒光、偽影和信號弱等不足，且需要通過多元統計分析方法構建診斷模型。

拉曼光譜可以在分子水平上分析疾病的變化，為疾病診斷和治療效果評價提供客觀和可量化的信息。使用拉曼光譜技術可以更加深入地了解浸潤性乳腺癌的浸潤過程，獲得的化學信息可以定量定性地分析疾病。熒光等干擾給生物樣品拉曼光譜的獲取和解析帶來了巨大的困難，因此仍然需要開發獲取、處理和分類數據的技術，通過對原始數據進行預處理，消除不需要的信號，增強拉曼光譜特征實現數據的定性和定量分析，從而判斷乳腺組織的病變性質。隨著拉曼光譜數據庫、組織分類方法和儀器設計的不斷改進，獲取分辨率和準確度更高及采集時間更短的拉曼光譜數據將成為可能，從而實現癌癥早期診斷，避免不必要的活組織檢查，即時、快速判斷乳腺癌保乳術的手術切緣，保證完全切除腫瘤。