流感病毒研究現(xiàn)狀與進展

馬 洲， 關(guān) 明， 邢志芳， 曹國君

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院檢驗科，上海 201907；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)科，上海 200040）

流行性感冒是由流感病毒引發(fā)的急性呼吸道傳染病，春、秋季節(jié)高發(fā)，亞太地區(qū)高發(fā)[1]。

1 流感病毒病原學(xué)

流感病毒是直徑為80～120 nm的球形或絲狀的單股負鏈分節(jié)段RNA病毒，屬正黏病毒科，其基因組包括8個獨立的RNA片段[2]，第1、2、3 片段分別編碼PB1、PB2、PA，參與病毒遺傳物質(zhì)的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄；第4片段編碼血凝素（hemagglutinin，HA），介導(dǎo)受體結(jié)合和膜融合，是流感病毒的主要免疫原性蛋白；第5片段編碼核蛋白（nucleoprotein，NP），NP與病毒組RNA及PB1、PB2、PA相連構(gòu)成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP），參與病毒的裝配和RNA的合成；第6片段編碼神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA），NA可以清除細胞表面的唾液酸，防止病毒粒子聚集，促進病毒的釋放；第7片段編碼基質(zhì)蛋白（matrix protein，MP），MP中的M1能維持病毒的形態(tài)，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其與NP是病毒分型的依據(jù)；第8片段編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NEP/NS2，NS1能拮抗宿主的非特異性免疫，并抑制干擾素產(chǎn)生，NEP/NS2可促進病毒RNA的表達，并參與其轉(zhuǎn)運過程。

根據(jù)NP和MP的抗原性差異，流感病毒可以分為甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒及丁型流感病毒4類。（1）甲型流感病毒。該病毒宿主眾多、血清型復(fù)雜，能夠通過基因重組和適應(yīng)性突變獲得跨宿主傳播能力。人類對甲型流感病毒缺乏持久的免疫力，所以所有年齡段人群均普遍易感，甲型流感病毒是引起流行性感冒大流行的最主要病原體[3]。甲型流感病毒表面蛋白HA有16個亞型，NA有9個亞型，病毒可根據(jù)HA和NA的組合情況進一步分類為若干亞型。由于HA和NA抗原結(jié)構(gòu)能通過基因位點的突變或基因重組使病毒變異，因此甲型流感病毒屬中的禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）能夠突破種屬屏障感染人類，目前能夠感染人類的AIV有：H5N1、H5N6、H6N1、H7N7、H7N9等亞型[4]。AIV曾暴發(fā)式大流行，涉及多個國家和地區(qū)，如2009年暴發(fā)的甲型H1N1流感病毒[4]。（2）乙型流感病毒。該病毒多在小范圍內(nèi)流行傳播，目前無亞型之分，引起人類感染的主要是乙型Yamagata系或乙型Victoria系。亞太地區(qū)的15個國家在每個月的流行性感冒確診病例中，乙型流感病毒的確診率為0～92%[1]，與甲型流感病毒不同，兒童、老年人等特定人群易感乙型流感病毒，并易引發(fā)并發(fā)癥，對社會造成的負擔甚至超過甲型流感病毒[5]。（3）丙型流感病毒。該病毒檢出率較低，通常導(dǎo)致輕度感染，對公共衛(wèi)生和健康影響較小。（4）丁型流感病毒。該病毒是最近幾年才被發(fā)現(xiàn)的，主要感染牛、羊、豬等[6]。

2 流行性感冒的臨床表現(xiàn)與病毒的傳播途徑

流行性感冒的臨床表現(xiàn)主要為：咳嗽、鼻塞、頭痛、咽喉痛、食欲減退、胸骨后不適、肌肉酸痛等全身性不適。甲型流感病毒感染患者常伴有發(fā)熱，體溫可達39 ℃，甚至超過39 ℃。感染乙型流感病毒的兒童多表現(xiàn)為嘔吐、腹痛、腹瀉。無并發(fā)癥的流感病毒感染患者多為自限性病程，發(fā)病1周左右高熱逐漸消退，全身癥狀好轉(zhuǎn)。在兒童、孕婦、老年人和免疫缺陷群體等高危人群中，流感病毒可誘發(fā)嚴重的病毒性肺炎，導(dǎo)致多器官衰竭或基礎(chǔ)疾病惡化。因兒童呼吸道保護屏障發(fā)育不完善，更易引起咽喉炎、支氣管炎或肺炎等癥狀，有26.5%的季節(jié)性流行性感冒住院患兒可并發(fā)肺炎[7]。老年人由于常伴有呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等原發(fā)疾病，感染病毒后病情較重且進展快，肺炎發(fā)生率高于青壯年人群，且易誘發(fā)心力衰竭、急性心肌梗死或并發(fā)腦炎等疾病，在65歲以上老年人群中，流行性感冒相關(guān)死亡率與年齡呈正相關(guān)[8]。女性在懷孕期間呼吸系統(tǒng)功能明顯改變，且免疫系統(tǒng)會介導(dǎo)細胞免疫向體液免疫轉(zhuǎn)移，因此孕婦對于流感病毒的抵抗力更弱，感染后易發(fā)生肺炎、呼吸困難，甚至有流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎死宮內(nèi)等風(fēng)險[9]。

被流感病毒感染后，患者的呼吸道分泌物中存在大量的流感病毒顆粒，可在打噴嚏和咳嗽時通過飛沫傳播。此外，流感病毒也可通過口腔、鼻腔、眼睛等黏膜直接或間接接觸傳播[10]。對人類造成嚴重影響的AIV的傳播方式主要是通過接觸被感染禽類及其排泄物等，尚未發(fā)現(xiàn)人傳人的現(xiàn)象[11]。由于病毒結(jié)合受體存在差異，甲型流感病毒通過人類呼吸道中的SAα2-6唾液酸受體感染宿主，而AIV感染禽類則是通過結(jié)合禽類胃腸道上的SAα2-3唾液酸受體[12]，因此AIV是否能實現(xiàn)宿主間的傳播，關(guān)鍵在于其受體結(jié)合能力。

3 流感病毒的致病機制

流感病毒表面的HA和NA均有助于流感病毒的傳播、增殖，且極易發(fā)生基因重組，增強病毒的致病性。HA能夠識別宿主細胞表面的SA受體并與其結(jié)合，通過胞吞作用進入細胞內(nèi)，促進M2離子通道的形成，而M2可促進病毒粒子進入宿主細胞核進行復(fù)制。同時，NA有助于新形成的病毒顆粒被釋放，病毒即是以這種方式在細胞間傳播。HA還含有對B淋巴細胞產(chǎn)生中和抗體起關(guān)鍵作用的抗原決定簇，因此HA的表位是影響病毒突變和重組機制的主要決定因素，其高變異性使病毒能夠逃避宿主的免疫監(jiān)視[13]。HA能夠迅速活化蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），有利于病毒的侵入復(fù)制，并通過PKC—Ot的活化和核蛋白輸出進一步激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路，使核輸出更為有效，進一步促進病毒的復(fù)制。除此之外，非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NEP/NS2的存在為病毒在宿主體內(nèi)復(fù)制定植創(chuàng)造了基礎(chǔ)條件，其中NS1能對抗宿主天然免疫反應(yīng)，抑制干擾素產(chǎn)生；NEP/NS2則參與拮抗宿主抗病毒反應(yīng)。

在免疫應(yīng)答初期，細胞因子會幫助宿主抵抗病毒感染，但長期的持續(xù)感染會導(dǎo)致相關(guān)信號通路被激活，引起多種炎癥因子級聯(lián)放大，形成細胞因子風(fēng)暴，從而導(dǎo)致急性肺損傷[14]。病毒的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR），包括Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）、RIG-I樣受體（RIG-I like receptor，RLR）和NOD樣受體（NOD like receptor，NLR）等，是抑制重癥感染誘發(fā)免疫性病理損傷及研究非特異性免疫應(yīng)答的重要靶點，流感病毒通過操縱這些信號分子可以有效使被感染宿主致病。TLR是病原體的主要傳感器，TLR3介導(dǎo)病毒dsRNA的識別，TLR4介導(dǎo)急性肺損傷，高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）識別TLR4后活化核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）產(chǎn)生干擾素（interferon，IFN），可導(dǎo)致重癥肺炎[15]。TLR7/8介導(dǎo)病毒ssRNA的識別，激活NF-κB，促進多種炎性細胞因子的分泌[16]。NLR能誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細胞因子，但過度活化會導(dǎo)致免疫損傷，如NLRP3過度活化可導(dǎo)致非致命性流感病毒感染中的嚴重肺損傷[17]。除此之外，流感病毒能夠激活p53，抑制干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白，維持病毒的傳染性，并可促進病毒繁殖[18]。

4 流感病毒的檢測方法

目前，臨床實驗室檢測流感病毒的方法主要為病毒分離培養(yǎng)、病毒抗原檢測、病毒核酸檢測等。

4.1 病毒分離培養(yǎng)

分離培養(yǎng)是最傳統(tǒng)的病毒檢測方法。將患者樣本接種于細胞或胚胎中，繁殖7～10 d，監(jiān)測細胞是否發(fā)生病變，然后通過特異性染色或免疫熒光顯微鏡等最終確認是否存在流感病毒[19]。離心細胞培養(yǎng)法（shell viral culture，SVC）是另一種病毒培養(yǎng)方法，與傳統(tǒng)的病毒分離方法相比更簡單、快捷、靈敏，可在24～48 h檢測到病毒[20]，特異性高，是病毒感染診斷的金標準，也是疫苗研制的基礎(chǔ)，但培養(yǎng)病毒耗時長、易發(fā)生支原體污染，難以滿足大量樣本或大量病原體快速檢測的需求。

4.2 抗原檢測

常用的抗原檢測方法有直接免疫熒光法（direct immuno fluorescence，DFA）和流感病毒快速診斷測試（rapid diagnosis test of influenza，RIDT）。DFA是通過熒光直接標記流感病毒的特異性抗體，在熒光顯微鏡下觀察鼻咽拭子的呼吸道上皮細胞中有無特異性病毒抗原；RIDT是采用免疫層析法，用膠體金或乳膠顆粒標記流感病毒抗體，通過抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，30 min即可判讀結(jié)果[21]?？乖瓩z測的優(yōu)點是操作方便、檢測周期短、效率高，能滿足短時間內(nèi)檢測大量樣本的需求；缺點是檢測敏感性和特異性不夠高，只能區(qū)分甲型和乙型流感病毒，無法區(qū)分病毒的亞型，且抗原抗體易發(fā)生非特異性結(jié)合。

4.3 核酸檢測

4.3.1 聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的快速發(fā)展讓傳染病診斷有了更廣闊的空間，相比抗原檢測，核酸檢測更為敏感，能夠在早期檢出臨床樣本中的病毒。目前用于人類流感病毒感染的檢測方法有：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（reverse transcription loop mediated isothermal amplification，RT-LAMP）、基于簡單擴增的檢測（detection based on simple amplification，SAMBA）、依賴核酸序列的擴增（amplification of DNA dependent sequences，NASBA）和微陣列技術(shù)等[20]。其優(yōu)點是檢測敏感性和特異性好，能夠精確鑒別未知流感病毒株的分型，適用于篩選和鑒定亞型流感病毒。缺點是僅限于對單一病原體型別進行診斷，檢測時間較長、操作復(fù)雜，對實驗室和操作人員要求較高，且結(jié)果易受基因突變、抑制劑和RNA降解影響。

4.3.2 基因測序法 測序是基因診斷的金標準，通過測序技術(shù)可以準確、快速地獲取生物體的遺傳信息。ZHAO等[22]利用RT-PCR——下一代測序（next generation sequencing，NGS）診斷平臺對161份臨床樣本進行檢測，結(jié)果表明該平臺能夠在核酸低濃度條件下實現(xiàn)與實時RT-PCR相同的高靈敏度，并且能夠提供流感病毒基因組全譜，實現(xiàn)多重識別和功能意義的同步鑒定。SEONG等[19]采用NGS深度測序技術(shù)，檢測了鼻咽拭子等臨床樣本，結(jié)果表明該方法能有效地應(yīng)用于調(diào)查致病性流行性感冒的分子特征。LEE等[23]在MiSeq測序器上開發(fā)了一種檢測試劑盒和軟件，對148份H3N2甲型流感病毒樣本進行測序，結(jié)果表明該方法能有效控制高通量測序的樣本污染率，并比Sanger測序更加高效。高通量測序法的優(yōu)點是檢測結(jié)果準確度高，可以對流感病毒進行準確的基因檢測和分型，即使在發(fā)生基因突變的情況下也能實現(xiàn)，但檢測成本較高、周期長，難以滿足快速檢測大量樣本的需求，樣本與樣本之間存在交叉污染的可能，易造成假陽性。

4.4 其他檢測方法

流感病毒的檢測方法多種多樣，芯片技術(shù)是其中之一。芯片技術(shù)起源于微機電系統(tǒng)，現(xiàn)已被用于多種病原體的檢測。SHEN等[24]開發(fā)了一種以HA、NA陣列為特征的微流控芯片，通過使用聚糖包被的磁珠和RT-PCR，實現(xiàn)流感病毒的快速檢測，并可在100 min內(nèi)完成12種甲型流感病毒亞型的檢測。LU等[25]建立了一個磁控數(shù)字化微流控平臺，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測甲型H1N1病毒抗體，整個分析過程可在40 min內(nèi)完成，且靈敏度高，在快速診斷流感病毒方面具有很大的潛力。芯片技術(shù)反應(yīng)效率高、檢測通量高、試劑消耗少，但設(shè)備昂貴，操作比較復(fù)雜，只能檢測已知的位點，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

5 流感病毒感染的治療及預(yù)防

流感病毒表面的NA能促進成熟病毒顆粒脫落傳播，而神經(jīng)氨酸酶抑制劑（neuraminidase inhibitors，NAIS）可以與NA特異性結(jié)合，從而抑制病毒的傳播、釋放。奧司他韋能夠?qū)⒛c道中的酯酶轉(zhuǎn)為活性代謝物，從而干擾病毒的傳播，患者入院6 h內(nèi)用藥，有助于縮短住院時間、改善生存率[26]。但如果患者入院時已經(jīng)出現(xiàn)了下呼吸道感染癥狀，即使使用奧司他韋，也無法更好地改善癥狀或降低病死率，但雷帕霉素和奧司他韋聯(lián)合使用，對已發(fā)生嚴重免疫損傷的患者有一定療效[27]，原因在于藥物可通過抑制ALRP3介導(dǎo)的信號通路，進一步抑制病毒復(fù)制和免疫過度，緩解肺損傷嚴重程度，降低患者死亡率。帕拉米韋作為唯一的靜脈注射類NAIS，療效要優(yōu)于其他NAIS，且對兒童和成人均有效，比口服奧司他韋能夠更有效地縮短退燒時間[28]，但可能會與其他 NAIS相互耐藥，且對奧司他韋耐藥的患者療效不理想[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，咖啡酸與帕拉米韋聯(lián)合使用能增加藥物對NA的親和力，是解決耐藥性問題的突破口[30]。雖然長期使用帕拉米韋會誘導(dǎo)流感病毒位點的突變，削弱病毒復(fù)制能力，但會導(dǎo)致患者對所有的NAIS耐藥，應(yīng)謹慎使用[31]。

隨著對NAIS耐藥病例的日益增多，具有不同機制的新型抗病毒藥物被研發(fā)出來，如巴洛沙韋。巴洛沙韋是一種帽依賴性核酸內(nèi)切酶抑制劑，能夠抑制病毒自身mRNA的轉(zhuǎn)錄[32]。有研究結(jié)果顯示其不良反應(yīng)發(fā)生率顯著低于奧司他韋[33]。

每年全球范圍內(nèi)的流行性感冒病例中，有300萬～500萬例嚴重病例，與呼吸道疾病相關(guān)的死亡病例為29萬～65萬例[34]，接種疫苗仍是目前最有效的防范手段?，F(xiàn)有的流感疫苗包括裂解疫苗、減毒活疫苗、全病毒滅活疫苗等。人用流感疫苗通常采用的是雞胚法，但其操作復(fù)雜、生產(chǎn)周期長，目前科學(xué)家積極研發(fā)了犬腎細胞（Madin-Darby canine kidney，MDCK）、非洲綠猴腎細胞（african green monkey kidney cell，Vero）和人胚胎成視網(wǎng)膜細胞（human embryonic retinoblasts，PER.C6）等基于細胞培養(yǎng)的技術(shù)，用于流感疫苗的制備[35]。除了接種疫苗，在流行性感冒高發(fā)季節(jié)，建議采取佩戴口罩、勤洗手等防護措施，同時增強自身免疫力，注意保暖及空氣的流通。如出現(xiàn)感冒癥狀，應(yīng)注意休息，避免去人群密集場所造成病毒的二次傳播，有發(fā)熱現(xiàn)象應(yīng)及時就醫(yī)。

6 展望

流感病毒每年均反復(fù)引發(fā)人類呼吸道疾病，給社會經(jīng)濟和人類健康造成了沉重的負擔[36]。目前預(yù)防和控制流行性感冒最為有效的措施就是接種疫苗。盡管公共衛(wèi)生組織建議6月齡以上的人群都應(yīng)接種流感疫苗，尤其是兒童、老年人、孕婦等易感人群及免疫功能缺陷的群體，然而由于流感疫苗的接種主要基于自愿、自費和我國人口基數(shù)龐大、流感疫苗需每年接種等原因，很大程度上影響了我國疫苗的接種覆蓋率[37]。我們無法預(yù)測流行性感冒的發(fā)展趨勢，是否會出現(xiàn)新的亞型、是否會跨物種傳播、是否會造成新的大流行，所以仍需對流感病毒進行深入研究，積極研發(fā)更有效的疫苗和抗病毒藥物，積極開發(fā)更有效的檢測手段，盡量避免大流行的出現(xiàn)，確保公眾健康。