環狀RNA在腫瘤中的研究進展

李 勇 郭 敏

癌癥高發生率及高病死率已經成為制約人類生活質量的公共衛生事件。由于大多數腫瘤的病因復雜，給后續的診治帶來困擾。然而環狀RNA因其豐富的生物學功能逐漸進入人們的視野，并在腫瘤學領域掀起了一股研究熱潮，最近研究發現環狀RNA在腫瘤組織及體液中存在差異性表達，除了參與并介導甲狀腺癌、肝癌、白血病等多種腫瘤的增殖、浸潤、遷移等惡性病理過程，在輻射及化療藥物作用下發揮增敏或抗性作用。

一、環狀RNA的研究進展及結果

根據主要歷史事件及重大成果，環狀RNA的研究大致可分為以下幾個階段：第1階段：1976 年Sanger等[1]在植物類病毒中發現了一類共價閉合環狀分子，首次提出環狀RNA的概念，自此拉開了環狀RNA研究的序幕；第2階段：1976～2012年，環狀RNA不斷被發現存在于各種生物體內，由于檢測工具的制約，其被認為是無功能的剪接意外的產物，未給予足夠重視[2]；第3階段：2012～2013年，環狀RNA的形成機制首次得以揭示，此外其作為microRNAs海綿這一重要生物學功能被證實，環狀RNA的研究自此進入高潮階段[3]；第4階段：2013年至今，以單分子測序技術和SMRT技術為代表的第3代高通量測序技術應用于環狀RNA檢測，由于存在不能重復檢測、費用高等問題，限制了其應用。截止目前發現環狀RNA具有豐富、穩定、保守、半衰期長、特異性高、在組織及體液中廣泛存在并差異性表達等特點，但由于環狀RNA的研究尚處于初級階段，發掘其潛在的功能對于闡明腫瘤發生、發展的具體機制，作為新的有效靶點具有重要意義。

二、環狀RNA的生物學功能

1.作為miRNA“海綿”：作為miRNA“海綿”發揮競爭性內源RNA機制是目前發現circRNA最主要的調節機制，circRNA可以通過與相應的miRNA靶向結合，進而調節靶基因的表達。其中circ-ITCH具有多個miRNA結合位點，可與miR-7、miR-17、miR-214、miR-22-3p靶向結合，且在宮頸癌、甲狀腺癌等多種腫瘤中低表達，發揮促癌作用。此外有研究發現cESRP1可以通過海綿樣吸附miR-93-5p-p21，調控相應靶基因及通路，增加小細胞肺癌化療敏感度[4]。可見circRNA-miRNA機制除了參與腫瘤的惡性進程，還可能作為化療藥物的增敏劑，發揮正性調控作用，抑制腫瘤的進展。

2.調節親本基因表達:研究表明，不同來源的環狀RNA在不同物種中對親本基因的調控存在差異[5]。如存在于細胞核且包含有一段或多段內含子序列的外顯子來源的環狀RNA EIciEIF3J和EIciPAIP2以順式作用形式與U1小核RNA和RNA聚合酶Ⅱ結合到核糖核蛋白，促進其親本基因的表達；而分布在細胞質中僅包含外顯子的circRNA,則是通過與線性轉錄本相互作用間接影響親本基因的轉錄。而最近一項研究發現擬南芥(arabidopsis)separalata3(SEP3)第6外顯子產生的環狀RNA通過形成R-環(RNA:DNA雜交)調控其親本基因(SEP3)的表達，這是理解植物中環狀RNA分子機制的第一項成果[6]。可見，環狀RNA通過多樣的方式調節親本基因的表達。

3.與RNA結合蛋白相互作用:circRNAs與RNA結合蛋白(RBP)的相互作用類似于其與miRNA。本質上，一些環狀RNA含有RNA蛋白結合位點，這些結合位點對某些RBP具有高親和力，從而阻止了它們在細胞中的可用性和隨后的作用。研究發現果蠅黑胃肌蛋白(MBL)是具有特殊功能的RBP[7]。過表達的MBL蛋白可促進circMBL產生而抑制其線性mRNA的產生，此外circMBL也可以通過與MBL蛋白結合抑制后者的堆積。而這一機制的產生依賴側翼內含子序列中功能性MBL結合位點的存在。近年來研究發現，高水平的circPABPN1抑制了HuR與PABPN1的結合，HuR和circPABPN1在調控PABPN1翻譯方面作用正好相反[8]。推測circPABPN1與HuR的結合阻止了HuR與PABPN1 mRNA的結合，從而降低了PABPN1的翻譯，這是circRNA與其同源mRNA競爭RBP影響翻譯的首例。

4.翻譯蛋白質:環狀RNA除了調控親本基因的表達，還可以通過特殊的機制影響蛋白質的翻譯。如部分病毒蛋白的翻譯依賴于內部核糖體進入位點(IRES)和細胞免疫反應；而在真核翻譯系統中，cirRNA的翻譯不需要包含IRES的元素，含有小核糖體的開放性起始前復合物的結合是真核生物典型翻譯過程的起始步驟。果蠅S2細胞circRNA的表達依賴于表達V5標記蛋白的內含子-外顯子-內含子微基因的存在。而含有N6-甲基腺苷的環狀RNA(m6A-cirRNA)在熱休克應激作用下促進GFP蛋白的翻譯，參與發育和細胞周期調節等過程[9]。此類具有翻譯蛋白質功能的環狀RNA將在不同層面上揭示人類生命活動中許多病理生理機制。

5.與癌癥相關的融合circRNA(fusion-circRNAs,f-circRNA)協助腫瘤細胞“逃逸”:研究表明與癌癥相關的染色體易位會產生融合環狀RNA，這些融合的circRNA是由易受影響的不同基因的轉錄外顯子產生，不在正常細胞中表達，其存在有助于細胞轉化，影響細胞活力，促進細胞存活和治療抵抗，在體內扮演癌基因的角色[10]。此外特定基因誘導的染色體易位除了產生融合蛋白和激活特定的致癌途徑外，還促使新融合環狀RNA的形成，且f-circRNA和circRNAs通常與線性轉錄體共用外顯子，推測環狀RNA與f-circRNA之間存在競爭關系,此外研究證實f-circRNA在染色體形成后早期出現，而不僅僅是腫瘤發生過程的產物。

6.作為傳播媒介:研究證實circRNA 在人體體液中大量存在并發揮促癌作用，如其在子宮內膜癌患者血清細胞外囊泡(EVs)的濃度高于健康對照組，提示其可作為一種信息載體，在細胞內及細胞間傳遞信息[11]。進一步研究這些EV-carried circRNAs的作用將有助于揭示腫瘤侵襲、轉移的潛在機制。此外最近研究發現，植物circRNAs有可能作為信號分子通過木質部和韌皮部在細胞間長距離傳遞，這一發現將拓寬circRNA作為信息分子的應用范圍[12]。

三、環狀RNA與各系統腫瘤

1.環狀RNA與呼吸系統腫瘤

環狀RNA與肺癌：近年來研究發現，失調的環狀RNA在肺癌的惡性進展、化療耐藥等中發揮重要作用。Zhou等[13]研究發現，hsa-circ-0004015在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)組織中明顯高表達，且其表達量與NSCLC生存率呈負相關，敲除hsa-circ-0004015可顯著降低細胞的活力、增殖和侵襲能力,此外hsa-circ-0004015/miR-1183/PDPK1軸調控NSCLC的增殖、侵襲和耐藥，提示其潛在的診斷及治療價值。同樣Zhu等[14]研究發現hsa-circ-0013958在肺腺癌組織、細胞和血漿中均上調，功能實驗證實hsa-circ-0013958通過結合miR-134，上調癌基因cyclinD1，進而促進肺腺癌的惡性進展，提示hsa-circ-0013958有望成為肺腺癌新型無創篩查指標。

2.環狀RNA與消化系統腫瘤

(1)環狀RNA與肝癌：Wei等[15]研究發現circ-CDYL在早期肝癌組織較中晚期肝癌組織顯著高表達，其一方面通過結合miR-892a和miR-328-3p，促進相應的下游靶基因表達而激活肝癌相關的通路發揮促癌作用。另一方面增加上皮細胞黏附分子(EPCAM)+的肝癌起始細胞(T-ICs)比例，促進肝癌細胞的自我更新、惡性增殖、抗藥性和成瘤特性。此研究揭示了circ-CDYL作為新型分子，在肝癌的發生、發展及抗藥性等中意義深遠。此外，體內外實驗表明，circ-DB通過抑制miR-34a和激活與去氫泛素相關的USP7/CyclinA2信號通路促進肝癌生長并減少DNA損傷，敲除circ-DB可逆轉脂肪外泌體對肝癌細胞的影響，提示circ-DB有望成為高效的非侵入性早期肝癌的診斷指標[16]。綜上所述，對此類失調的環狀RNA的探索，有助于揭示肝癌發展和化療耐藥規律，為提高肝癌診治率和預后奠定基礎。

(2)環狀RNA與胃癌:研究顯示環狀RNA在胃癌組織及體液中普遍下調。如Shao等[17]研究發現，hsa-circ-0014717在胃癌組織中下調且能穩定存在于人胃液中，其表達水平與腫瘤分期、遠處轉移、CA19-9的表達等顯著相關，但其在健康組、胃潰瘍和胃癌組之間無明顯差異表達，僅在慢性萎縮性胃炎組顯著降低，然而慢性萎縮性胃炎被認為是胃癌的高危因素之一，提示hsa-circ-0014717有望成為早期胃癌高危人群的篩選指標。此外該研究發現，在健康胃黏膜、胃炎、腸化生到胃癌發生4個階段中，hsa-circ-0065149僅在胃癌階段表達明顯下調，而在其他3個階段中含量無差異，且其在胃癌組織中的低表達與腫瘤直徑、神經周圍浸潤以及高總生存期顯著相關[18]。此外他們發現hsa-circ-0065149在早期胃癌患者血漿外泌體中同樣顯著下調，且較傳統臨床生物學標志物敏感度和特異性更高。提示hsa-circ-0065149作為胃癌新型的無創檢測標志物，聯合其他生化指標將顯著提高胃癌檢出率。然而Huang等[19]研究發現上調的circAKT3參與胃癌順鉑耐藥的形成。

(3)環狀RNA與結直腸癌：結直腸癌是世界范圍內最常見的癌癥之一，其發生率及病死率均較高，越來越多的研究報道了環狀RNA推動了結直腸癌進展。研究發現，在大腸癌血漿和細胞系中顯著上調的hsa-circ-0082182和hsa-circ-0000370與淋巴結轉移密切相關，下調的hsa-circ-0035445與TNM分期密切相關[20]。但均與年齡等臨床特征無關。且hsa-circ-0082182和hsa-circ-0035445在大腸癌術前和術后血漿中表達有顯著性差異，而hsa-circ-0000370在這兩個階段差異無統計學意義。這3個circRNAs聯合較單個用于鑒別診斷具有更高的精準度，提示這3個環狀RNAs在大腸癌早期無創診斷中潛在的價值。此外Abu等[21]推測表達上調且在細胞外小泡中存在的hsa-circ-32883可能是化療敏感的分子指標。

3.環狀RNA與內分泌系統腫瘤

環狀RNA與甲狀腺癌：甲狀腺癌是內分泌系統中最常見的惡性腫瘤，其發生率逐年升高。最近研究發現環狀RNA在甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)的發生、發展以及耐藥性中扮演重要角色。Minnan等[22]首次揭示了過表達circ-ITCH通過與miR-22-3p靶向結合上調b-連環蛋白E3連接酶CBL的表達抑制Wnt/β-catenin通路的激活，從而抑制PTC的進展。然而Ren等[23]研究發現，在甲狀腺組織中hsa-circ-047771的低表達與BRAFV600突變、淋巴結轉移及TNM分期有關，其高表達與TNM分期顯著相關。提示這些失調的circRNAs在PTC的發病機制中起著重要作用。此外，近年來研究發現，上調的circEIF6參與甲狀腺癌順鉑耐藥性的形成，提示circEIF6可能作為反轉甲狀腺乳頭狀癌化療耐藥的分子靶點[24]。

4.環狀RNA與生殖系統腫瘤

環狀RNA與宮頸癌:Xu等[25]研究發現,hsa-circ-0109046和hsa-circ-0002577在子宮內膜癌患者的血清外泌體中顯著高表達，提示其潛在的宮頸癌無創檢測價值。然而體內外實驗均證實circ-ITCH在宮頸癌組織及細胞中低表達，上調circ-ITCH可通過circ-ITCH/miR-93-5p/FOXK軸發揮抑癌作用，可見這些差異性表達的環狀RNA在宮頸癌診療中具有潛在價值[26]。

5.環狀RNA與其他腫瘤

研究表明hsa-circ-0000885在骨肉瘤組織及血清中明顯上調，且其高表達與骨肉瘤不良預后相關[27]。此外在中晚期骨肉瘤及骨肉瘤肺轉移患者血清中同樣發現hsa-circ-0000885高表達，而在骨肉瘤化療或手術后hsa-circ-0000885顯著下調。可見其有望成為骨肉瘤診斷、治療效果及不良預后監測的良好的生物學標志物。此外朱昆鵬等[28]研究發現，hsa-circ-0004674在化療耐藥的骨肉瘤細胞系和組織中明顯上調，且其表達水平與骨肉瘤患者不良預后有關，提示hsa-circ-0004674作為骨肉瘤化療耐藥檢測指標。

近年來研究發現，在鼻咽癌患者患者血清中circMAN1A2高表達，此外在口腔癌、甲狀腺癌、卵巢癌以及肺癌患者中同樣發現circMAN1A2顯著高表達，進一步評價其臨床特征，發現在上述5種腫瘤中circMAN1A2均表現出較高的診斷價值，其中在鼻咽癌中診斷價值最高[29]。總之，血清中circMAN1A2的檢測將成為新型無創的惡性腫瘤的篩查指標。

四、展 望

綜上所述，環狀RNA具有多種生物學特性及功能，廣泛存在于生物體內，在外泌體、血漿等非組織中表達失調，顯示出其無創、高效的早期診斷以及動態監測腫瘤變化等方面潛在的價值。對于部分具有相同miRNA結合位點的環狀RNA而言，他們在功能上是否存在協同或抑制尚不清楚，研究清楚這一點將對腫瘤多靶點協同調控具有重要參考意義。此外大多數腫瘤標本未分期或分級；樣本量及檢測技術局限；缺乏對差異表達的circRNA的動態檢測以及對腫瘤患者長期追蹤，這些均可影響檢測結果。對以上問題的解決將使人們更全面地認識circRNA這一新興分子，為其今后的臨床應用打下堅實的基礎。