線粒體結構及功能異常在骨關節炎軟骨退變中的作用研究進展

覃文聘 閆艦飛 焦 凱

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是人類最常見的關節退行性疾病，最新的全球疾病負擔研究的數據顯示全世界大約有2.42億人罹患骨關節炎[1]。隨著社會人口老齡化，這個數字還在快速上升，由OA疾病引起的經濟投入占到發達國家GDP總量的1.0%～2.5%[2, 3]。OA較高的發生率及其所帶來的危害使其成為致殘的重要原因[4]。隨著疾病的發展，OA進展到晚期往往需要關節置換，給患者帶來極大的痛苦以及沉重的經濟負擔[5]。目前認為OA發病為多因素共同作用的結果，其致病因素包括異常生物力、遺傳因素、細胞老化與凋亡、局部炎性因子、自由基及蛋白酶等。關節軟骨退變被認為是OA典型的病理特征，由于軟骨組織中沒有血管和淋巴管，因而軟骨細胞被認為生活在缺氧的環境中。線粒體，一個在有氧的條件下進行氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)反應，再經過三羧酸循環、電子傳遞，最終產生ATP，為細胞的生命活動提供能量的細胞器，在軟骨細胞代謝活動中的作用研究就相對較少，但新近研究顯示線粒體結構以及功能異常與OA軟骨退變的發生、發展關系密切，本文就該領域的最新研究做一綜述。

一、OA中線粒體的改變

1.線粒體呼吸鏈(mitochondrial respiratory chain, MRC)損傷：線粒體呼吸鏈是位于線粒體內膜上的一系列電子和質子傳遞體系，包括復合體Ⅰ煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)-CoQ氧化還原酶，復合體Ⅱ琥珀酸-CoQ氧化還原酶，復合體ⅢCoQH2-細胞色素c氧化還原酶，復合體Ⅳ細胞色素c氧化酶。線粒體膜電位(Δψm)是質子跨膜轉運時形成的跨線粒體內膜的電位，正常的線粒體膜電位是維持線粒體進行氧化磷酸化、產生ATP等生理過程的重要前提。Maneiro等[6]通過分析呼吸鏈酶復合物和檸檬酸合成酶(citrate synthase, CS)活性以及線粒體膜電位的變化來評價OA軟骨細胞與正常軟骨細胞線粒體的功能差異，實驗中對照組軟骨來自無關節病史而且大體正常的人膝關節軟骨，OA組軟骨來自準備進行關節置換的股骨頭OA軟骨，結果發現，與對照組關節軟骨細胞比較，OA軟骨細胞CS活性顯著升高，復合體Ⅱ和Ⅲ活性顯著降低，復合體Ⅰ及Ⅳ活性與對照組比較差異無統計學意義。隨后，他們通過熒光探針四乙基苯并咪唑碘化物JC-1測定線粒體Δψm的水平，結果發現OA軟骨細胞具有比對照軟骨細胞更低的紅綠熒光比率，即OA軟骨細胞線粒體去極化更為明顯，且Δψm顯著降低。上述結果表明OA軟骨細胞存在MRC功能障礙，造成電子傳遞效率下降進而導致ATP合成量下降及Δψm的降低。

研究表明MRC功能障礙可產生更多的漏電子, 使得氧自由基增加，高水平的氧自由基可通過脂質氧化作用破壞細胞膜，使細胞發生自溶；其次，氧自由基可以使DNA鏈發生斷裂，造成DNA堿基的損傷；同時，氧自由基還可阻止透明質酸酶的合成并使其降解，導致關節滑液黏度降低，關節的潤滑機制遭到破壞；氧自由基還會影響花生四烯酸的代謝，促進其酶促反應的發生，產生炎性反應。有研究已經證實MRC功能障礙會導致軟骨細胞發生炎性反應，并上調其COX-2和PGE2的表達[7]。Reed等[8]通過分離培養新生鼠肋軟骨細胞，并用不同濃度的氧化應激誘導劑甲萘醌處理細胞1h后,分別即刻收集細胞或培養1或24h后收集細胞，用線粒體超氧化物指示劑MitoSOX重懸細胞，通過流式細胞儀分析樣品中線粒體活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產生，通過Southern法分析mtDNA的損傷，通過Western blot法分析金屬基質蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的生成，結果顯示，與對照組比較，甲萘醌可顯著促進軟骨細胞線粒體ROS的產生，這種顯著的差異甚至在甲萘醌處理后24h仍持續存在；mtDNA的損傷和MMPs的產生均隨甲萘醌濃度升高而加重。上述結果表明氧化應激的線粒體會生成更多的ROS，并對mtDNA造成損傷且促進MMPs表達。

此外，Cillero-Pastor等[9]證明了MRC功能障礙會造成軟骨細胞中MMPs的過度表達，進而導致軟骨的降解破壞。MMPs能夠降解細胞外基質，其中膠原酶MMP-1，MMP-8，MMP-13分別主要以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原為水解底物，間質溶解素MMP-3可以降解蛋白聚糖等，因此MMPs可以對關節軟骨的纖維軟骨結構造成破壞，使軟骨基質降解，在OA的發生和發展中扮演了重要的角色。Cillero-Pastor等[9]以正常人膝關節軟骨細胞為研究對象，使用MRC復合物Ⅴ抑制劑寡霉素處理細胞后，分別使用實時定量PCR技術、Western blot法及ELISA等方法研究了MMPs的mRNA和蛋白質的表達及組織中蛋白多糖的含量變化，結果顯示，經處理的軟骨細胞MMP-1和MMP-3 mRNA及蛋白表達水平較溶劑對照組顯著上調。他們用同樣的方法刺激體外培養的軟骨組織塊，所獲得的結果與細胞水平的結果一致，表明當軟骨細胞存在MRC功能障礙時，其可通過調節軟骨細胞中MMPs的表達來促進OA軟骨退變的進展。

另外，有使用關節軟骨的體外研究表明，使用特定的MRC抑制劑可抑制蛋白多糖和膠原的合成，如在體外使用魚藤酮抑制復合物Ⅰ降低了表面和中間軟骨的蛋白多糖含量[10，11]。

2.線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)的改變：mtDNA編碼細胞色素c氧化酶復合體(復合體Ⅳ)催化活性中心的亞單位(COXⅠ、COXⅡ、COX Ⅲ)及ATP酶亞單位等蛋白質、多肽和RNA，控制著線粒體氧化磷酸化和ATP的合成等過程。線粒體呼吸鏈是產生內源性氧自由基的主要場所之一，mtDNA由于結構和位置的特殊性，使其更容易被氧自由基攻擊。氧自由基可以使DNA鏈發生斷裂并阻斷DNA分子的修復以及合成，從而造成DNA堿基的損傷。已有研究證實OA患者中mtDNA損傷要高于正常人而其修復能力則低于正常人[12]。

流行病學研究也發現mtDNA單倍群類型與OA患病風險存在一定的相關性。mtDNA單倍型群,定義為以mtDNA序列中存在一組特定的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)為特征的個體群，是人類mtDNA中最常見的遺傳突變的結果，并且當人類遷徙到較冷的氣候時，它們會受到氣候選擇的影響[13]。有研究表明mtDNA單倍群G的人群發生膝關節OA的風險會顯著增加，而單倍群B4的人群發生膝關節OA的風險則相對較低[14]。王宇等[15]通過對187 例膝關節OA 患者的研究同樣發現，mtDNA單倍群G在OA患者中出現的頻率明顯高于對照組，而且病情更為嚴重，而mtDNA單倍群B和B4在OA患者中出現頻率則明顯較低。 Soto-Hermida等[16]通過對膝關節骨性關節炎患者4年的隨訪研究發現，在常見的歐洲mtDNA單倍群中，mtDNA單倍群T的膝關節軟骨厚度和體積與其他mtDNA單倍群的變化比較顯著減慢，而且變化幅度顯著降低，表明mtDNA單倍群T對OA的發生同樣具有保護作用。Fernández-Moreno等[17]利用具有相同核背景的骨肉瘤細胞系，通過融合來自攜帶單倍群J或H的健康供體的血小板來培養線粒體細胞系，其中一個具有單倍群J(與OA低風險相關)，另一個具有單倍群H(與OA的高風險相關)，在用過氧化氫處理后發現，在OA中的軟骨細胞存活率單倍群H只有單倍群J的一半。

對于mtDNA單倍型群對OA的作用機制仍有待于探究，目前發現mtDNA單倍型群對能量產生、NO的形成有重要影響[13]。一方面，不同的單倍型群的氧化磷酸化系統(oxidative phosphorylation system, OXPHOS)耦合效率存在差異，緊密耦合的OXPHOS會產生大量的ATP和少量的熱量，而部分不耦合的OXPHOS則產生少量的ATP和大量的熱量。單倍型J和單倍型T，兩種被證明對OA的發生有保護作用的mtDNA單倍型群，被描述為姐妹單倍型群，兩者均有部分非耦聯OXPHOS的特征，并產生較低的ATP和ROS；而單倍型H則有較強的OXPHOS耦聯效率和較高的ATP產生量[18]。另一方面，mtDNA單倍型群會影響細胞內NO的產生。關節軟骨內NO能與超氧陰離子結合生成過氧亞硝酸鹽，通過酪蛋白激酶2(casein kinase 2, CK2)信號激活核因子E2相關因子2(nuclear factor E2 related factor 2, Nrf2)，導致軟骨細胞血紅蛋白加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)上調，從而損傷DNA、蛋白質、脂類以及染色體端粒，進一步導致細胞質丟失和細胞死亡[19]。最近研究表明，單倍型J攜帶者的軟骨細胞中NO的產生和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)mRNA合成降低[20]。這些研究說明mtDNA單倍群的類型與膝骨關節炎的發生有一定相關性，對mtDNA單倍群的分組可對OA治療相關的臨床試驗有所幫助[21]。

3.線粒體自噬的異常：自噬是細胞移除自身內部受損的大分子和細胞器、維持其穩態的重要途徑，其中線粒體自噬是一種選擇性清除受損線粒體的特異性自噬類型[22]。在應激狀態下，當線粒體的融合與分裂已無法降低應激效應時，分裂時產生的膜電位較低的線粒體則會發生線粒體自噬，從而幫助細胞自身去除受損的線粒體。該過程由兩種不同的分子途徑介導：PTEN誘導激酶1(PTEN induced putative kinase1, Pink1)/Parkin途徑以及維BH3結構域蛋白2家族成員(BH3-only member of the Bcl-2 family, Nix)/Bcl-2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3樣蛋白(adenovirus E1B19kDa interacting protein 3-like, BNIP3L)途徑。當線粒體自噬過程出現異常時，就會導致受損線粒體的更新發生障礙以及ROS的過量累積，從而造成細胞的氧化應激損傷。Lopez等[22]以永生化的人軟骨細胞TC28a2系細胞作為研究對象，使用線粒體呼吸鏈復合物Ⅴ抑制劑寡霉素處理細胞，結果顯示寡霉素處理組軟骨細胞表達自噬體標志物輕鏈3膜結合形式Ⅱ(LC3)斑點較溶劑對照組顯著減少，進一步蛋白質印跡分析結果顯示，細胞LC3-Ⅱ的表達在寡霉素處理后24h增加，至48h開始減少。他們認為LC3-Ⅱ表達的增加可能是早期的應激反應，最終LC3-Ⅱ表達減少表明在線粒體功能障礙時，自噬激活減少。他們進一步通過構建自噬相關基因Atg5 siRNA的載體進入正常人軟骨細胞來抑制線粒體的自噬活動，發現線粒體Δψm降低和ROS產生增加，表明OA軟骨細胞存在線粒體自噬缺陷，從而導致功能障礙的線粒體在細胞內異常積累，進而引起軟骨細胞代謝功能的紊亂。研究表明，軟骨的病理性礦化是OA 軟骨退變的典型特征，Pei等[23]研究發現，軟骨病理性礦化可能與線粒體自噬活動密切相關，礦化前體非晶態磷酸鈣在線粒體中富集后通過囊泡轉運至細胞外的過程中存在線粒體的自噬現象。在線粒體中，鈣和磷聚集成非晶態磷酸鈣，其過度積累會導致Pink1在線粒體膜上的積累，進一步會誘導Parkin從基質轉移到功能失調的線粒體上，并以線粒體為靶點啟動線粒體自噬，自噬體攜帶非晶態磷酸鈣轉運到細胞外，從而啟動基質的礦化。

4.線粒體鈣代謝的改變：線粒體不僅是細胞重要的能量代謝場所，同時是一個非常有效的維持細胞內鈣離子穩態的緩沖系統。研究顯示，線粒體功能和Ca2+動力學過程相互調節、密切交織[26]。線粒體跨膜電位是氧化磷酸化過程的基礎，同時也是Ca2+進入線粒體的驅動力；線粒體內的Ca2+通過調節4種線粒體脫氫酶(丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、氧代戊二酸脫氫酶和甘油-3-磷酸脫氫酶)的活性，正向調控檸檬酸循環，從而促進線粒體膜電位的產生[24]。組織學上，細胞基質內Ca2+流入線粒體由線粒體鈣單向轉運蛋白(mitochondrial calcium uniporter, MCU)控制；而流出則由線粒體Na+/Ca2+交換體控制。線粒體通透性轉換孔 (mitochondrial permeability transition pore, mPTP )的瞬時開放也被認為是一種額外的Ca2+流出模式，與其他蛋白通道共同維持線粒體及細胞內部鈣離子的穩態。研究表明，骨關節炎軟骨細胞內質網(endoplasmic reticulum, ER)釋放的Ca2+和(或)由細胞外流入的Ca2+增加，會導致線粒體內Ca2+濃度增加。增加的線粒體Ca2+通過刺激三羧酸循環的酶、氧化磷酸化來促進ATP合成，代謝率的增加會消耗更多的氧氣，導致細胞呼吸鏈電子泄漏和ROS水平增加，從而激發氧化應激損傷，進而促進軟骨退變的發生[25]。另一方面，由于線粒體Ca2+超載導致mPTP的開放，進一步造成Δψm突然下降和細胞色素c、凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor, AIF)等促凋亡蛋白被釋放到細胞質中，這一過程在細胞凋亡中起了關鍵作用。細胞凋亡可由兩種途徑造成：由位于細胞膜上的受體識別細胞外信號觸發的外在途徑和由DNA損傷或氧化應激等內部事件觸發的內在途徑，線粒體參與外在途徑的增強和內在途徑的激活。

二、靶向調控線粒體功能阻斷骨關節炎進展

考慮到線粒體結構以及功能異常與OA軟骨退變的發生、發展關系密切，靶向調節線粒體功能成為治療OA的新思路。Reed等假設軟骨基質降解酶MMPs表達水平將隨著線粒體產生的ROS的減少而降低，因此抑制線粒體ROS的產生可起到阻斷OA軟骨退變的作用。他們采用線粒體靶向的抗氧化劑MitoTempo處理人骨關節炎軟骨細胞，該抗氧化劑具有超氧化物和烷基自由基清除性質。OA軟骨細胞經抗氧化劑處理后，其MMP3及MMP13的蛋白表達水平較溶劑對照組顯著降低，且該效應存在顯著的劑量及時間依賴效應，即在本研究條件下，抗氧化劑處理OA軟骨細胞時間越長，濃度越高，MMP3及MMP13的蛋白表達水平就越低，表明線粒體ROS的清除能顯著降低OA軟骨細胞分泌MMPs，從而發揮阻止OA軟骨退變進展的作用[8]。有研究者證實了具有抗氧化活性的脂聯素(adiponectin, APN)對H2O2誘導的細胞內ROS可以清除活性，降低H2O2誘導的小鼠成肌細胞毒性，同時ANP可以恢復由H2O2抑制的成肌細胞的線粒體膜低電位，防止線粒體發生去極化。他們還發現APN可以抑制H2O2誘導的成肌細胞的線粒體自噬和細胞凋亡，但是關于其在軟骨細胞中是否可以發揮同樣的作用需要開展進一步研究。

自噬激活可以保護人軟骨細胞免受線粒體功能障礙所誘發的級聯病理反應。Lopez等[22]分別用雷帕霉素復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC-1)靶向選擇性抑制劑雷帕霉素和mTORC-1和mTORC-2抑制劑Torin 1預處理TC28a2系軟骨細胞4h誘導自噬，隨后在指定的時間內添加線粒體呼吸鏈復合物Ⅴ抑制劑寡霉素，通過測定自噬體形成標志物輕鏈3膜結合形式Ⅱ(LC3-Ⅱ)分析自噬激活。雷帕霉素處理組的Δψm增加，并且細胞凋亡水平顯著降低(P<0.05)，用Torin 1預處理也可以顯著增加Δψm(P<0.01)，而且伴隨著ROS產生和凋亡的顯著降低(P<0.05)，這一結果表明自噬激活對線粒體功能障礙具有保護作用。海藻糖作為一種新型自噬誘導物，Tang等[26]研究發現其在叔丁基氫過氧化物(tert-Butyl hydroperoxide, TBHP)處理的小鼠軟骨細胞和不穩定的內側半月板(destabilized medial meniscus, DMM)小鼠OA模型中均具有保護作用。進一步研究發現海藻糖可以選擇性地恢復氧化應激誘導的自噬通量破壞和靶向自噬，改善氧化應激介導的線粒體膜電位變化，ATP水平降低，動態蛋白相關蛋白1(dynamin-related protein 1, DRP-1)易位至線粒體，以及線粒體和內質網(ER)應激相關凋亡途徑中蛋白質上調而具有抗凋亡的作用。

已知Pink1/Parkin通路是線粒體自噬的關鍵通路，當Pink1在外線粒體膜上聚集且穩定化后將選擇性募集Parkin，在后者被募集到損傷的線粒體后，Parkin通過其E3泛素連接酶活性促進多種線粒體膜的降解。Ansari等[27]通過研究確定了Parkin在病理條件下清除損傷、功能失調的線粒體的功能。他們利用IL-1β刺激OA軟骨細胞未病變區域來模擬病理狀況，使用Amaxa系統轉染Parkin突變體或野生型質粒，通過測定Δψm、ROS水平和ATG5、Beclin1蛋白的自噬情況，最終證明在病理情況下，Parkin可以誘導自噬作用來消除軟骨細胞中去極化和損傷的線粒體，保證了線粒體的質量。另外，caspase-9是線粒體凋亡途徑的關鍵組成部分，對caspase-9的抑制也是一種保持細胞活力的可能的方法[10]。在單側前交叉韌帶橫斷誘導犬OA時，用caspase-9抑制劑 Z-lehD-FmK體外培養的OA膝關節軟骨細胞凋亡程度明顯降低。

綜上所述，骨關節炎軟骨退變發生過程中存在線粒體功能的異常，主要包括線粒體呼吸鏈的破壞、線粒體DNA的受損、線粒體自噬活動以及鈣離子代謝的改變，從而導致軟骨細胞氧化應激損傷、基質降解酶MMPs過量表達、軟骨基質異常鈣化以及關節軟骨對各種刺激的耐受性顯著降低等病理改變，最終導致OA的發生和發展。在了解其發病機制的基礎上，研究者發現抑制線粒體呼吸鏈損傷及ROS產生、調控線粒體自噬功能能有效減緩OA軟骨退變的進程。但是目前的研究大都停留在理論研究，為了達到最終OA治療的目標，還需要深入的臨床前和臨床研究。