蛋白質組學在系統性血管炎中的研究進展

蔡昕添 吳 婷 李南方

系統性血管炎是一組原因不明的、以血管壁和(或)管壁周圍組織炎癥和壞死為基本病理改變的結締組織疾病，根據受累血管類型、位置、病理特征等情況的不同，可導致相應的組織和器官出現缺血的表現，臨床上常表現為皮膚破壞、多部位關節炎甚至多臟器衰竭。目前，系統性血管炎的診斷主要依靠患者的臨床表現、影像學檢查、病理活檢、動脈造影以及結合實驗室檢查檢測到的一種或多種自身抗體來確定[1]。然而，目前臨床常用的診斷方法其效率與準確率均不高且存在一定的局限性。生物學標志物雖早已應用于臨床之中，且為非侵入性檢查，對患者傷害小，可反復進行。但目前僅少數生物學標志物可用于系統性血管炎的診斷，如抗中性粒細胞胞質抗體(anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)對于ANCA相關性血管炎(ANCA-associated vasculitis，AAV)的診斷具有重要臨床價值，但對于病情評估尚存爭議；如紅細胞沉降率和C反應蛋白等炎性生物學標志物，但其特異性較差，無法區分血管炎與感染[2]。這些標志物或許有助于系統性血管炎的診斷，但對疾病活動與復發的評估價值并不大。因此，尋找新型診斷及評估病情變化的特異性生物學標志物，以期更早制定出新型的治療方案，提高系統性血管炎患者生存率和生活質量，是臨床亟待解決的重大問題。

蛋白質組學作為一門新興的科學和技術，已受到眾多學科的廣泛關注，成為當下的研究熱點。目前，蛋白質組學技術廣泛應用于腫瘤、心血管疾病及自身免疫性疾病的研究之中，對深入探究疾病發生、發展機制、早期篩查與診斷、個性化治療、預后評估都有著極其重大的意義[3]。它的發展完善為系統性血管炎的研究帶來了全新的思維模式，開拓出全新的研究領域，對探討系統性血管炎發病機制、早期診斷和治療及改善預后具有重大意義[4]。本文通過查閱國內外相關文獻對蛋白質組學及其在系統性血管炎，尤其是在巨細胞動脈炎、川崎病、ANCA相關性血管炎、白塞病、過敏性紫癜中的研究進展做一綜述。

一、蛋白質組學

蛋白質組學是應用多技術對特定生物液體、細胞或組織內所表達的全部蛋白質進行鑒定，并分析其表達水平及修飾狀態，研究其結構、功能以及相互作用。通過蛋白質組學技術的研究，不僅能了解疾病發展的物質基礎，還能為疾病機制的闡述及疾病的攻克提供可靠的理論依據和有效的解決途徑。

二、蛋白質組學技術在系統性血管炎中的應用

1.巨細胞動脈炎：巨細胞動脈炎(giant cell arteritis，GCA)是一種肉芽腫性大血管炎，常影響主動脈及其主要分支，尤其是顳動脈。其臨床表現可因受累部位不同而表現復雜，甚至出現失明等嚴重并發癥。因此，早診和早治是預防這種疾病發生不可逆損害的關鍵[5]。Alexis等[6]采用2-DE聯合MS技術將GCA患者顳動脈活檢分離得到的血管平滑肌細胞(vessel smooth muscle cells，VSMCs)與來自健康對照組的VSMCs進行差異蛋白質分析，結果發現26種差異蛋白，其中內皮素-1(endothelin-1，ET-1)被認為是GCA中VSMCs增殖的關鍵激活物，這也再次證實此前Planas-Rigol等[7]所得出的結論：ET-1在GCA血管病變中顯著上調，并通過促進VSMCs向內膜層遷移，進一步加重GCA中血管內膜增生和血管閉塞情況。以上研究表明ET-1等蛋白質對于GCA的診斷及病情預后判斷可能具有較大的提示價值。ET-1是內皮素家族的成員之一，內皮素家族成員(主要包括ET-1、ET-2和ET-3)都是由21個氨基酸組成的活性多肽，是目前已知最強的縮血管物質之一，參與多種疾病的病理生理過程。而ET-1是唯一存在于內皮細胞的內皮素，除有收縮血管作用外，還可介導血管內皮損傷及刺激血管平滑肌細胞增殖。近年來多項研究表明其參與了多種系統性血管炎的發病機制[8]。然而，其特異性與敏感度仍有待于進一步開展大樣本隊列研究予以證實。

2.川崎病：川崎病(kawasaki disease，KD)是一種嬰幼兒時期常見的急性系統性血管炎。它主要累及中、小血管，并可導致一系列心血管系統的嚴重并發癥[9]。為尋找診斷KD的新型生物學標志物，Alex等[10]運用蛋白質組學技術分析了KD患者與高度懷疑KD但最終證實為其他發熱性疾病患者的血清和尿液，發現兩種免疫調節相關分子僅在KD患者尿液中高表達，包括金屬蛋白酶Meprin A和細絲蛋白C。更有意義的是，研究者利用前瞻性盲法研究驗證了這兩個指標，最終在不同隊列中再次證實KD患者血清與尿液中Meprin A和細絲蛋白C水平顯著高于對照組。并且與目前常用的實驗室檢查比較，這兩種標志物對于癥狀不典型KD均表現出更為優異的診斷效能。此外，Yayoi等[11]采用LC-MS/MS技術比較了急性期與恢復期KD患者的血清蛋白質，結果顯示急性期患者血清中LBP、LRG1和AGT的表達水平顯著高于恢復期患者，而急性期患者血清中RBP4的表達水平則明顯低于恢復期患者。這提示以上蛋白可作為預測KD活動性的潛在生物學標志物。目前，臨床上KD治療最常用、最有效的方案仍為口服阿司匹林和大劑量靜脈注射丙種球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIG)聯合[12]。然而IVIG存在眾多不良反應，甚至是致命性的不良反應，如急性腎衰竭和血栓栓塞，所以評估該方案是否利大于弊是極為必要的[13]。Zhang等[14]采用2-DE和MALDI-TOF/TOF-MS對IVIG治療前后的患者血清進行蛋白質差異表達分析，共鑒定出29種差異表達的蛋白質，其中最有價值的蛋白質是轉甲狀腺素蛋白(transthyretin，TTR)。KD患者的TTR水平顯著高于健康對照組，且IVIG治療起效后，TTR可恢復到正常水平，但在IVIG治療無效的患者中TTR并沒有這種變化，這或許可作為評估KD患者IVIG療效有無的潛在指標。

3.ANCA相關性血管炎:AAV是一系列以壞死性炎性反應為特征的小血管炎。ANCA是目前診斷AAV最常檢測的血清標志物，但并非所有AAV患者都能檢測到ANCA，且ANCA的血清水平并不總能準確反映AAV的活動度[15]。因此，需要尋找更多的生物學標志物用于AAV的診斷及其活動度的評估。此外，因AAV常同時累及多臟器，所以發掘能反映特異性器官損傷的生物學標志物也尤為重要。Régent等[16]采用13C/15N標記結合LC-MS/MS的方法對健康者和AAV患者治療前(活動期)與治療后(緩解期)的血清進行蛋白質差異表達分析，共鑒定出多種差異有統計學意義的表達蛋白質。并在另一更大樣本量的AAV患者隊列中對以上蛋白質進行了敏感度與特異性的分析鑒定，最終選定組織金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)為監測AAV活動的最佳生物學標志物，這一結論也證實了Bjerkeli等[17]的研究結果，活動期GPA的TIMP-1水平顯著高于非活動期與健康對照組。

Rani等[18]采用2-DE和MALDI-TOF-MS分析了GPA活動期患者、緩解期患者以及健康對照3組間血清中的差異表達蛋白質。研究結果顯示與緩解期及健康對照組比較，活動期患者血清中發現了多種差異表達蛋白質。其中觸珠蛋白可能是反映GPA疾病活動最重要的標志物。維生素D結合蛋白、CD91和IL-17可用于活動期與腎損傷的監測。以上幾種蛋白質均可用于診斷和預后判斷，但其實際的臨床價值仍有待于進一步評估。

4.白塞病：白塞病(Behcet′s disease，BD)是一種變異性血管炎，可累及全身各處血管，當累及中樞系統、泌尿系統等重要臟器時常致死致殘。為應對這一挑戰，Hu等[19]利用血清標本，采用了Hu-Prot技術分別分析了BD、大動脈炎、ANCA相關性血管炎、干燥綜合征和健康受試者中差異表達的蛋白質，并通過更大樣本量的隊列進行了驗證，發現抗-CTDP1抗體在BD患者中的表達明顯高于疾病對照組和健康對照組。此外，Cheng等[20]通過LC-MS/MS分析了BD患者血清同其他風濕免疫性疾病、健康對照之間差異表達的蛋白質，從BD外周血循環免疫復合物中鑒定出多種自身抗原。并針對自身抗原微管蛋白-α-1c的自身抗體進行了進一步的研究，發現它在BD中表達顯著增高，這或許是一種全新的BD診斷標志物。研究者還發現抗微管蛋白-α-1c自身抗體與深靜脈血栓形成等并發癥密切相關，而且其血清水平與BD活動度呈正相關。但研究者尚不清楚是抗微管蛋白-α-1c抗體導致了內皮細胞損傷及局部血管炎性反應，還是血管炎性反應誘導產生了抗微管蛋白-α-1c抗體。所以有必要進一步研究微管蛋白-α-1c及其自身抗體在BD中的發病機制。

5.過敏性紫癜：過敏性紫癜(henoch-schonlein purpura，HSP)是一種由IgA介導的小血管炎，又名IgA血管炎(IgA-vasculitis，IgAV)，通常涉及皮膚、關節、胃腸道以及腎臟，其中腎臟受累者(IgA vasculitis with nephritis，IgAVN)預后往往極差。目前為止，尚無明確的實驗室檢查能用于確診HSP[21～23]。孫秀坤等[21]通過CM10芯片結合SELDI-TOF-MS技術，分析了HSP伴發腎炎患者與HSP不伴腎炎患者尿液中的差異表達蛋白質譜，并利用SVM算法建立由多個標記蛋白構成的IgAVN的早期診斷模型，這些標記蛋白能在尿檢發現隱血、尿蛋白之前即可測得，這為IgAVN的早期診斷提供了可能。當然該模型的穩定性與可重復性仍有待于不同隊列的進一步驗證。

He等[22]納米級超高效液相色譜-質譜(nano LC-MS/MS)研究了IgAV、IgAVN和健康受試者之間在血清中差異表達的蛋白質，并通過ELISA進一步驗證了其中豐度差異較大的蛋白質，如血管緊張素原和激肽原-1等。最終，研究者發現血清中血管緊張素原濃度與IgAVN發病密切相關，且其可作為判斷IgAV預后的潛在標志物。Mao等[23]研究也發現尿血管緊張素原濃度可用作判斷IgAV腎臟受累嚴重程度的潛在生物學標志物，并認為尿血管緊張素原水平的升高很可能直接參與了IgAV急性期腎損害的疾病進展。研究者還推測阻斷尿血管緊張素原的生成可能是治療重癥IgAV腎臟受累的一種有效方法。

三、展 望

由于系統性血管炎治療難度大且預后較差，因此盡早診斷是改善系統性血管炎患者預后的關鍵。鑒于目前系統性血管炎早期檢測手段的局限性，研究者一直在找尋其敏感度及特異性更高的早期診斷標志物。近年來，蛋白質組學的飛速發展為系統性血管炎的研究提供了全新思路。為揭示系統性血管炎發病機制及尋找早期診斷、療效評價和預后評估的可靠生物學標志物提供了極大的便利。但蛋白質組學技術在系統性血管炎的研究中仍存在無法回避的缺陷，如目前已發現的生物學標志物仍面臨難以大規模應用于臨床實踐、檢驗檢測流程仍未制定出標準化的規范和后期質控標準存在較大差異等困境。即便如此，隨著蛋白質組學理論研究的持續深入、系統性血管炎中蛋白組學研究數據的不斷積累以及實際實驗操作流程的逐步改進，這必將帶動系統性血管炎相關研究更進一步地發展。