鮑曼不動桿菌感染的免疫應答及免疫療法新進展

錢穎，謝永鵬，石遠峰，楊娜，劉克喜

(徐州醫科大學附屬連云港醫院 連云港市第一人民醫院重癥醫學科，江蘇 連云港 222000)

鮑曼不動桿菌(acinetobacter baumannii，AB)是一種廣泛分布于醫院環境的革蘭陰性菌，它具有抗干燥、抗氧化應激的能力，且難以被普通消毒劑殺滅，憑借頑強的生存能力可以長期在醫院環境中存活[1]。與其他一般細菌相比，AB的耐藥比例高、耐藥性強，且具有快速獲得耐藥及克隆傳播的特點，其多耐藥、泛耐藥、全耐藥菌株以前所未有的速度在世界流行，給抗感染治療帶來了極大的挑戰[2]。AB常導致危重患者發生呼吸機相關性肺炎、血流感染，對于重癥患者AB導致的血流感染的病死率超過70%[3-4]。AB導致的病死率和醫療負擔在2017年世界衛生組織公布的耐藥菌排名中名列榜首[5-6]。AB的超級耐藥性使感染的治療變得艱難，因此必須尋求其他辦法控制這種機會性致病菌引起的感染。細菌的清除和感染的控制不僅取決于抗生素，也取決于宿主的免疫反應，因此有必要了解免疫系統如何應對這種病原菌。固有免疫在抗感染方面發揮著重要作用，目前關于AB與免疫系統相互作用的研究主要集中在固有免疫。現就AB感染的免疫應答及免疫療法的新進展予以綜述。

1 AB感染的免疫應答

1.1固有免疫系統對AB的識別 固有免疫細胞的模式識別受體通過識別病原體相關分子模式啟動固有免疫應答，因此免疫細胞的激活在很大程度上依賴于模式識別受體識別病原體相關分子的能力。AB的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、外膜蛋白(outer membrane protein，Omp)、外膜囊泡(outer membrane vesicle，Omv)以及莢膜多糖等抗原成分可被免疫細胞的多種模式識別受體識別[7]。

1.1.1Toll樣受體(toll-like receptors，TLR) TLR是參與AB識別的最經典模式識別受體，AB的LPS可通過TLR-4激活巨噬細胞的核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路和促分裂原活化的蛋白激酶信號通路，導致大量的炎癥因子釋放，如腫瘤壞死因子、白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8、IL-12，隨后導致中性粒細胞募集，發揮殺菌作用[8-9]。此外，TLR-9作為一種識別胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤基序(CpG)DNA的模式識別受體，可通過胞內定位作用識別AB的核酸，從而激活NF-κB信號通路，TLR-9的存在可減少AB的肺內定值和限制AB的肺外播散[10]。最近，Marion等[11]證實，AB的毒力因子Omv作為一種含有多種細菌成分(LPS、Omp、脂類等)的分泌型囊泡也能被TLR-2和TLR-4識別，其中TLR-4介導的促炎反應占據優勢。TLR-2也是參與AB識別的重要組件，但關于TLR-2的激活是否有利于AB的清除還存在爭議，這可能與用于研究的AB菌株、感染模型、劑量以及刺激途徑等有關[12]。TLR家族以不同的方式參與眾多毒力因子以及核酸序列的識別，把控著下游眾多的促炎反應，在固有免疫中占據十分重要的地位，因此通過干預這些重要靶點可能對未來的免疫調節治療具有十分重要的作用。

1.1.2核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR) NLR作為一種胞質內模式識別受體也參與AB的識別。核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide binding oligomerization domain，NOD)1和NOD2可以識別上皮細胞吞噬的AB，然后通過受體相互作用蛋白2介導，啟動下游NF-κB信號通路產生促炎反應，當該過程被阻止時，AB入侵肺上皮細胞，并且易在肺上皮細胞增殖和存活[13]。此外，NOD2可通過促進活性氧類和活性氮的產生，在肺部感染早期發揮防御作用，經研究證實，在AB感染前應用NOD2配體預先激活上皮細胞可以起到保護作用，可見調控NOD1及NOD2通路可能是一種有效的控制AB肺部感染的治療策略[14]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體也是參與AB識別的重要元件，AB感染后可通過NLRP3-凋亡相關微粒蛋白-胱天蛋白酶(caspase)1通路促使巨噬細胞分泌IL-1β，介導防衛[15]。Dikshit等[16]的研究發現，在小鼠肺炎模型中泛耐藥AB菌株可通過NLRP3依賴的方式促使IL-1β和IL-18表達，介導免疫防衛，但在標準菌株中這種防衛作用并未體現。Kang等[15]的研究證實，NLRP3炎癥小體介導的免疫對于標準菌株沒有防衛作用。由此可見，不同AB菌株具有不同的免疫原性，但對于臨床高度耐藥的AB菌株，NLRP3可能成為其免疫治療的靶點。

1.1.3晚期糖基化終末產物受體(receptor of advanced glycation end-product，RAGE) RAGE可以識別細菌的LPS，且RAGE作為一種模式識別受體可以誘導并加劇炎癥反應，RAGE-/-小鼠在AB導致的膿毒癥中表現出更小的菌量負荷和更高的存活率，經證實這與RAGE介導的抗炎因子IL-10表達受抑制有關[17]。由此可見，固有免疫細胞的識別對于后續的免疫殺傷及病原菌清除有重要作用，研究模式識別受體的作用機制無疑為未來的免疫調節治療奠定了基礎，但介于不同的AB菌株存在免疫原性差異，且幾乎所有的研究均停留于體外研究或動物體內研究階段，因此免疫調節作為臨床抗感染的策略還需繼續深入研究。

1.2上皮細胞及固有免疫細胞與AB的相互作用

1.2.1上皮細胞 上皮細胞是宿主發揮免疫防護作用的第一道防線，作為侵入基體的門戶，AB常黏附、定植于呼吸道上皮細胞表面，這一過程依賴于生物膜的形成，與該過程相關的AB毒力因子包括OmpA、生物膜相關蛋白(biofilm associated proteins，Bap)、Bap樣蛋白以及菌毛等，此外，還受到某些基因的調節[18]。有研究發現，AB分別與人皮膚上皮細胞和口腔上皮細胞共培養均可誘導產生β-防御素2和β-防御素3，同時還發現，這兩種防御素對AB的殺傷作用有一定的濃度依賴性[19]。同樣，AB也可刺激人氣道上皮細胞分泌這兩種防御素，發揮殺菌作用[20]。此外，肺泡上皮細胞在AB的刺激下可以激活NOD1/NOD2信號通路，進一步發揮免疫防衛作用[14]。由此可見，上皮細胞及其分泌產物共同組成了第一道免疫屏障，上皮細胞內的模式識別受體參與了AB的識別，進而發揮免疫保護作用。

1.2.2中性粒細胞 AB感染時可募集多種免疫細胞，其中占據中心地位的是中性粒細胞，它具有強大的吞噬和殺傷能力，與其他固有免疫細胞相比，中性粒細胞在對抗AB感染中貢獻最大[21-23]。早期的研究發現，單克隆抗體耗竭中性粒細胞后，感染AB的小鼠發生嚴重的肺部感染以及脾臟淋巴組織破壞，而當CT8+T細胞和樹突狀細胞(dendritic cell，DC)分別被耗竭后，細菌的清除力及易感性均未顯著改變[23]。Tsuchiya等[21]采用單克隆抗體分別耗竭中性粒細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞后，感染AB的小鼠存活率分別為0、50%和83%。由此可見，相對其他固有免疫細胞，中性粒細胞在AB導致的急性感染中擁有重要地位，因此中性粒細胞數量減少或功能降低將直接導致嚴重感染和不良預后。中性粒細胞產生的胞外誘捕是誘殺和滅活病原微生物的重要武器，AB以及許多其他致病菌可誘導胞外誘捕的形成，但AB與中性粒細胞共培養時可以抑制佛波酯誘導的胞外誘捕，進而避免被其網羅殺傷[24-25]，Kamoshida等[24]的研究表明，這一機制可能與AB抑制中性粒細胞的黏附有關。另一項研究發現，AB的苯乙酸代謝途徑受阻導致苯乙酸積累，而苯乙酸可引發中性粒細胞聚集，幫助其殺菌[26]，這一發現為新藥的研發拓寬了思路。總之，中性粒細胞作為對抗AB的主力軍，其作用機制十分復雜，目前的研究仍處于初步探索階段。

1.2.3巨噬細胞 雖然巨噬細胞在AB感染中的免疫作用沒有中性粒細胞明顯，但Qiu等[27]發現，巨噬細胞在防御反應早期有較強的吞噬作用，但在感染后期其吞噬作用顯著減弱。Méndez等[28]利用定量蛋白質組學技術發現，AB可適應巨噬細胞的存在，其中共培養組的AB與單獨培養組AB相比較共存在97個差異蛋白，說明AB可以通過自身調節適應巨噬細胞的存在，以幫助維持自身的生存。此外，AB還可誘導巨噬細胞焦亡，它既可以激活骨髓巨噬細胞caspase-1經典焦亡途徑，也可以激活caspase-11非經典焦亡途徑，誘導巨噬細胞焦亡，進而引發強烈的炎癥反應[29-30]。Wang等[29]利用小鼠肺炎模型證明了caspase-11的激活對AB感染小鼠具有保護作用，這種保護作用體現在缺乏caspase-11的小鼠清除AB的能力顯著降低，且肺部病變更加嚴重。而另一項研究則發現，對于AB誘發的肺部感染，抗菌肽hLF(human lactoferrin)(1-11)可以抑制依賴caspase-1活化和IL-1β產生的巨噬細胞焦亡，而且可減輕該過程帶來的肺部病理損傷[30]。hLF(1-11)的治療可能得益于抑制細胞焦亡引發的過度炎癥反應，可見炎癥反應的活化程度是影響預后的重要因素。最近的研究發現，AB的Omp34可刺激巨噬細胞的線粒體產生活性氧類，繼而激活NLRP3，然后繼續激活下游的caspase家族，引起細胞焦亡；相反，通過抑制線粒體產生活性氧類，則會減輕NLRP3過度活化帶來的傷害[31]。有個案報道，AB感染可導致巨噬細胞活化綜合征，發病機制可能與巨噬細胞的過度活化以及免疫失調導致的炎癥風暴有關[32]。總之，不管是巨噬細胞的活化還是焦亡，它們所引發的免疫反應在抗感染過程中均具有兩面性，適度的免疫反應主要表現為對病原菌的清除，而過度的免疫反應則會導致組織損傷，兩者如何平衡是一個十分復雜和艱難的問題。

1.2.4DC DC作為一種抗原呈遞細胞，是連接固有免疫和適應性免疫的橋梁。AB來源的Omv可促進DC在先天免疫階段產生IL-4等炎癥因子，在適應性免疫階段被Omv激活的DC可介導T細胞分化為輔助性T細胞(helper T cell，Th細胞)2，導致宿主對AB產生特異性免疫應答[33]。DC也可以通過TLR-4和TLR-2識別AB的LPS，處理并呈遞給CD4+T細胞，促使T細胞向Th1細胞分化[12]。早期的研究發現，DC能夠在AB毒力因子Omp的誘導下啟動適應性免疫應答，同時，嚴重的AB感染可導致DC出現功能障礙或死亡，最終限制適應性免疫發揮作用[34]。此外，當DC暴露于高濃度的OmpA時，OmpA可靶向作用于DC的線粒體，誘導活性氧類的產生，導致DC死亡[35]。可見，嚴重的AB感染可通過影響DC下調適應性免疫的應答作用。中性粒細胞作為“殺敵”的主力軍固然重要，但也離不開DC的幫助。DC可以通過TLR-4識別AB，釋放IL-1β，促使CD4+T細胞分化為效應Th17細胞，而Th17細胞是一種存在于呼吸道及皮膚等屏障組織中的免疫細胞，Th17分泌的IL-17具有強大的招募中性粒細胞的能力[36]。這體現了固有免疫的復雜性，各種免疫細胞需要互相協同抵御病原菌，通過干預其中某一環節可實現對機體的免疫調節。

2 AB感染的免疫療法

近年來，AB的耐藥性逐漸增加，目前已經出現全耐藥型菌株，對于AB而言，抗生素的黃金時代可能已經過去，抗感染治療面臨著前所未有的挑戰，而隨著人們對AB致病機制了解的加深，接種疫苗(主動免疫)和單克隆抗體療法(被動免疫)有望成為防治AB感染的新方法。

2.1疫苗 研制針對性的疫苗防治AB感染是眾多學者正在努力的方向。目前許多屬于AB的抗原已被了解，Omv、OmpA、Bap、莢膜多糖、自動轉運蛋白、多聚-N-乙酰葡聚糖等疫苗候選抗原可以顯著改善預后[37]。Omv和OmpA因具有較高的保守性及良好的免疫原性而得到較多的關注。動物實驗發現，用Omv行主動免疫和被動免疫均可產生良好的療效，且其免疫血清對5種臨床型菌株均有效[38]。OmpA是研究較為透徹的毒力因子，是目前較為熱門的候選疫苗，其主動免疫和被動免疫均有良好的療效[39-40]。Omv+Bap+OmpA組合形式也可以作為疫苗使小鼠對標準菌株和臨床多耐藥菌株產生保護性免疫，且這種組合形式降低了AB的選擇性壓力，同時增加了疫苗的有效性[41]。自動轉運蛋白是一種較為保守的表面蛋白，關于它的研究較少，早期的一項研究發現，自動轉運蛋白也是一種較為優秀的疫苗候選抗原[42]。莢膜多糖具有高度的變異性，目前已發現存在90余種莢膜多糖血清型，但用莢膜多糖制作的疫苗僅對部分菌株有效[43]，且莢膜多糖還會屏蔽OmpA而抑制針對性抗體的產生，干擾被動免疫[44]。而多聚-N-乙酰葡聚糖由于抗原性較弱，不能單獨作為疫苗抗原。為了給疫苗的研發尋找更多的可能，有學者運用蛋白質組學技術和基因組學技術篩選出了具有特異性和保守性的AB抗原[28]及基因序列[45-46]。疫苗的出現既可以幫助減少抗生素的接觸，又可以幫助有免疫缺陷或病情危重的患者。盡管這些制劑具有輔助或者替代抗生素的潛力，但目前尚無針對AB的疫苗超越Ⅰ期臨床研究階段，其中遇到的困難主要包括抗原序列的變異性以及臨床菌株的復雜性，因此仍需更深入的探索。

2.2單克隆抗體 單克隆抗體是一種靶向特定抗原的新型抗體，具有高度的專一性且不會誘導耐藥，針對特定的病原體靶向制備單克隆抗體也許能夠幫助治療高度耐藥的AB感染。Nielsen等[47]發現，針對AB莢膜成分的C8單克隆抗體有治療作用，用純化的C8單克隆抗體治療感染了致死劑量AB的小鼠，結果小鼠體內的細菌清除率顯著提高，小鼠的存活率也提高，且C8單克隆抗體與黏菌素聯合治療也表現出很好的協同作用，相對單藥治療存活率顯著提高。另外，AB可以通過形成生物膜避免宿主的殺傷和吞噬，且依賴生物膜定植于各種植入物表面。TRL1068是一種針對生物膜中DNABⅡ(deoxyribonucleic acid BⅡ)家族蛋白的單克隆抗體，動物實驗證實，亞胺培南聯合TRL1086治療多耐藥AB所致的導管相關皮膚軟組織感染有非常好的療效，與亞胺培南單藥治療相比，聯合治療組附著在導管處的細菌顯著減少[48]。但介于許多細菌均可以形成生物膜，且DNABⅡ表位高度保守，因此預測TRL1068具有廣泛的抗生物膜功效，如果可以應用于臨床將有益于那些帶有多種植入物的重癥患者。理論上說，單克隆抗體是治療疾病的特效藥，但最近的研究首次發現，單克隆抗體治療可導致AB感染加重，8E3是針對K2莢膜多糖的單克隆抗體，但應用8E3治療卻導致AB肺部感染小鼠病死率顯著增加，并導致體內細菌負荷的大幅增加，原因卻不明[49]。由此可見，單克隆抗體治療AB感染具有一定的復雜性和風險性，需要進一步研究以確定其有效性和安全性。

3 小 結

上皮細胞和巨噬細胞的模式識別受體可識別LPS、Omp、Omv、莢膜多糖等抗原以及核酸序列，啟動固有免疫應答。中性粒細胞一旦缺乏將導致極差的預后，但目前具體作用機制尚不明確，未來仍需更深入的探索。疫苗和單克隆抗體的研發給日漸嚴峻的抗感染領域帶來了曙光，但目前仍處于實驗室研究階段，尚不能對多數臨床菌株有效。基因組學及蛋白質組學技術正飛速發展，借助這些新興技術可能幫助研究者更全面和細致地了解AB獨特的基因及蛋白序列，使免疫治療更為精準有效。