腫瘤浸潤淋巴細胞在胃癌中的研究進展

陳倩文，劉璐，龍美玲，謝菲嵐，簡明威，劉錦濤

(1.廣東醫(yī)科大學研究生學院，廣東 湛江 524000； 2.廣東醫(yī)科大學深圳寶安臨床醫(yī)學院 深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院消化內科，廣東 深圳 518100； 3.深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院內鏡室，廣東 深圳 518100)

胃癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率位居世界第二，僅次于肺癌[1]。據我國2015年惡性腫瘤發(fā)病、病死數(shù)據顯示，胃癌發(fā)病率在男性和女性中分列第二位和第三位，而病死率均列第二位，我國胃癌新發(fā)病例和病死病例約占全球的42.6%和45.0%[2]。胃癌患者確診時大多已處于腫瘤晚期，導致胃癌術后預后較差，而常規(guī)的TNM分期通常難以準確評估胃癌術后復發(fā)、轉移以及生存期等預后情況，因此尋找有效的預后評估方案一直是胃癌研究的熱點和難點。腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)是目前關注的重點，TIL是宿主對腫瘤細胞免疫應答的表現(xiàn)，是機體識別和清除腫瘤細胞的基礎，TIL的組成、數(shù)量、分布及功能狀態(tài)決定了機體對腫瘤細胞的免疫反應。TIL的存在狀態(tài)與腫瘤預后密切相關，TIL作為各種人類惡性腫瘤的預后參數(shù)，在非小細胞肺癌[3]、食管鱗狀細胞癌[4]和乳腺癌[5]中均取得了一定的研究進展。對于胃癌，TIL可能是一種潛在的生物標志物。現(xiàn)就不同亞型TIL的密度、分布、功能狀態(tài)與胃癌臨床病理因素及預后關系的研究進展予以綜述。

1 胃癌TIL的組成及作用機制

TIL是一群存在于腫瘤及其間質內、以淋巴細胞為主的異質性免疫細胞，包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞(dendritic cell，DC)以及自然殺傷細胞(natural killer cell，NK細胞)等。1986年，Rosenberg等[6]首次從新鮮腫瘤組織中分離出TIL，此后的研究相繼發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中廣泛存在TIL，且TIL可以滲入基質和腫瘤中心。根據是否存在免疫細胞浸潤，腫瘤可分為炎癥性腫瘤和非炎癥性腫瘤[7]。炎癥性腫瘤是指腫瘤細胞被不同的浸潤性炎癥細胞(T細胞、B細胞、髓系白細胞、NK細胞和DC等)包圍，這些免疫細胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用也不盡相同。T細胞是細胞免疫中的主要效應細胞，按功能其可分為4類，即細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell，Tc細胞)、輔助性T細胞(helper T cell，Th細胞)、調節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)和記憶T細胞[8]。TIL中的T細胞以CD4+、CD8+為主，包括CD8+Tc細胞、CD4+Th細胞、叉頭框蛋白P3(forkhead box P3，F(xiàn)oxP3)+Treg細胞、CD45RO記憶T細胞等亞型[9]。

CD4+T淋巴細胞包括Th1、Th2、Th17、Th22及Treg細胞等亞群，而不同亞群對腫瘤演化的影響差異極大，故CD4+T細胞的作用因其異質性而變得相對復雜。其中，Th1細胞和Th2細胞是Th細胞的兩種主要類型，Th1細胞可以激活CD8+Tc細胞，而Th2細胞可以激活體液免疫；在誘導抗腫瘤免疫中，Th1細胞較Th2細胞激活更有效，因此高比值的Th1/Th2被認為是胃癌的有利預后因素[10]。Th17細胞和Th22細胞能產生多種炎癥因子，可促進胃癌的發(fā)展[11]。Xu等[12]發(fā)現(xiàn)，CD4+T細胞能通過磷酸化信號轉導及轉錄激活因子信號通路上調胃癌間充質干細胞中程序性細胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)的表達，促進胃癌細胞的遷移。CD8+T淋巴細胞是抑制/殺傷T細胞，主要負責特異性清除腫瘤細胞，是人體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤的主要細胞。Lee等[13]通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)，高密度CD8+T淋巴細胞與胃癌的良好預后相關，可作為胃癌患者良好預后的預測指標。Thompson等[14]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌瘤內和基質中CD8+T細胞密度的增加與無進展生存期和總生存期呈正相關。然而，Zhuang等[15]使用流式細胞學研究103例胃癌患者血液和腫瘤樣本中Tc17細胞的數(shù)量和表型發(fā)現(xiàn)，分泌白細胞介素-7的CD8+T細胞有促進胃癌進展的作用，提示腫瘤浸潤Tc17細胞(分泌白細胞介素-7的Tc細胞)與胃癌患者的預后不良相關。Treg細胞能抑制效應T淋巴細胞的功能，F(xiàn)oxP3表達陽性是其主要特征，F(xiàn)oxP3+Treg細胞陽性率越高，胃癌進展越快，患者存活率越低[16-17]。有研究表明，F(xiàn)oxp3+T細胞與CD4+T細胞以及FoxP3+T細胞與CD8+T細胞之間的數(shù)量平衡對抑制腫瘤轉移起重要作用，高比值的Foxp3+/CD4+和Foxp3+/CD8+提示預后不良[17-18]。CD45RO是最常用的記憶T細胞標志物，CD45RO+T細胞在許多人類癌癥中發(fā)揮重要作用。Hu和Wang[19]通過薈萃分析評估腫瘤浸潤性CD45RO+T細胞對人類實體瘤預后的影響，發(fā)現(xiàn)CD45RO+T細胞浸潤與實體瘤中無進展生存期和總生存期呈正相關；高密度腫瘤內CD45RO+T細胞與實體瘤的TNM分期呈負相關。

TIL的抗腫瘤免疫效應主要為細胞免疫效應，腫瘤-免疫循環(huán)理論認為，免疫系統(tǒng)識別和清除腫瘤細胞必須經歷三個階段：①在瘤內，死亡的腫瘤細胞釋放出特異性抗原DC識別和捕獲；②成熟的DC遷移到腫瘤引流淋巴結，將加工后的抗原呈遞給幼稚T細胞，刺激其增殖、分化為 Tc、Th和Treg細胞等；③激活的效應T細胞浸潤到瘤內，特異性識別和殺死癌細胞，并進一步釋放腫瘤特異性抗原，使其進入下一個腫瘤-免疫循環(huán)[20-21]。但在絕大多數(shù)癌癥患者中，免疫系統(tǒng)不能有效地發(fā)揮作用：可能由于免疫系統(tǒng)未能識別到腫瘤抗原，將腫瘤抗原視為自身，即表現(xiàn)為免疫耐受；效應T細胞無法浸潤到腫瘤病灶，或腫瘤微環(huán)境中的抑制因子(或免疫抑制性細胞)抑制效應細胞的功能[22]。此外，免疫系統(tǒng)在清除腫瘤細胞的同時也會對腫瘤細胞的特性進行“重塑”，使其惡性程度更高和抵抗免疫攻擊能力更強，即“免疫編輯”[23]。因此，免疫系統(tǒng)在腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展過程中具有“雙刃劍”的作用。TIL位于瘤內或間質，因TIL為腫瘤免疫作用的主要參與者，且TIL亞群種類繁多，不同亞群在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用差異極大，所以對腫瘤預后的影響也不盡相同。

2 TIL在胃癌中的功能狀態(tài)研究

浸潤到腫瘤組織的T細胞功能常處于失調狀態(tài)，活性較低，因此無法控制腫瘤生長。有證據表明，細胞的無能、衰竭和衰老是導致腫瘤微環(huán)境中T細胞功能失調的主要原因[24-25]。目前，常用抑制性受體CD57、T細胞免疫球蛋白及黏蛋白結構域分子3(T-cell immunoglobulin mucin domain-3，Tim-3)或程序性細胞死亡受體1(programmed cell death receptor 1，PD-1)的表達水平來表征T細胞的免疫耐受狀態(tài)，進而研究其與腫瘤之間的關系。

2.1CD57 CD57是存在于CD4+T細胞、分化晚期的CD8+T細胞及NK細胞等細胞膜上的糖蛋白[26]。CD57常用于鑒定增殖能力降低和功能特性改變的終末分化的衰老細胞。TIL作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在腫瘤微環(huán)境中CD57陽性淋巴細胞的功能引起了人們的廣泛關注，這些淋巴細胞在許多人類癌癥中發(fā)揮重要作用。CD57+淋巴細胞通常會在實體瘤中增加，可以說CD57的表達是免疫功能缺陷和復制衰老的特征[26-27]。以往研究提示，CD57分子的表達主要與NK細胞的分化發(fā)育有關，CD57+細胞可能就是高度成熟和終末分化的NK細胞[28]。Kared等[29]研究發(fā)現(xiàn)，血液和組織中的CD57+T細胞比例與慢性感染或各種癌癥及人類衰老的臨床預后相關，表明調控衰老CD57+T細胞的數(shù)量可能成為預防人類免疫衰老或各種慢性疾病的新方法。陳耀平等[30]研究表明，侵及胃壁全層的胃癌患者CD8+CD57+T細胞的百分率高于未侵及胃壁全層者，表明外周血中CD8+CD57+T細胞百分率增加可能促進腫瘤的局部浸潤。這與Akagi和Baba[31]的研究結果一致，該研究通過流式細胞術和細胞內細胞因子分析測定胃癌患者外周血中CD57+T細胞的比例，發(fā)現(xiàn)CD57高比例的患者術后存活時間顯著短于CD57低比例者。另外，Hu和Wang[26]通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)，CD57+終末分化的淋巴細胞浸潤與實體瘤患者的預后相關，且與胃癌3年和5年生存率均顯著相關；此外，CD57+淋巴細胞密度增加與實體瘤淋巴結轉移和TNM分期呈負相關。這些發(fā)現(xiàn)表明，CD57+淋巴細胞是人類實體腫瘤中抗腫瘤免疫力的重要參與者之一，可延緩腫瘤進展，提示CD57可能是預后的有用生物標志物。

CD57+淋巴細胞增加可提高患者生存率，可能與以下因素有關：CD57+T細胞和NK細胞等淋巴細胞中CD57的表達與顆粒酶A、顆粒酶B和穿孔素等細胞溶解酶的表達增加相關；當表達CD57抗原的CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞被刺激時，可以產生更多的γ干擾素，抑制腫瘤的生長；CD57+NK細胞可通過γ干擾素的分泌上調腫瘤細胞中主要組織相容性復合體Ⅰ類和Ⅱ類分子，使細胞毒性T淋巴細胞識別腫瘤特異性抗原，從而發(fā)揮抗腫瘤作用；CD57+NK細胞可以通過NK細胞和DC之間的相互作用增強T淋巴細胞的反應，從而誘導DC的成熟和激活[26,32]。因此推測，CD57+淋巴細胞能夠增強腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫反應，并對抗腫瘤的生長和擴散，提高患者的生存率。目前，關于CD57與胃癌預后關系的研究中，CD57主要用于識別TNM分期Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者的NK細胞，而CD57與T細胞的相關研究較少。

2.2Tim-3 Tim-3主要表達于Th1細胞表面，Tim-3與其配體半乳糖凝集素-9結合，通過Tim-3/半乳糖凝集素-9途徑產生抑制信號，誘導Th1細胞死亡，負調節(jié)Th1細胞免疫應答[33]。此外，在CD8+T細胞、Th17細胞、Treg細胞、DC以及NK細胞等淋巴細胞亞群中也發(fā)現(xiàn)了Tim-3的表達[34]。有研究表明，Tim-3是一種免疫負調控分子，在分化和成熟的Th1細胞表面表達，在浸潤各種腫瘤組織的T細胞表面Tim-3的數(shù)量和密度均增加[35-36]。另有研究表明，Tim-3在多種腫瘤組織中的表達除了與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關外[34,37]，還與T細胞耗竭有關[33]。目前已知Tim-3與T細胞功能的抑制有關[24,34]，但有關胃癌患者T細胞表面Tim-3表達的研究以及與Tim-3胃癌發(fā)展關系的研究相對較少。因此，研究Tim-3在胃癌患者癌旁和癌組織中T細胞表面的表達及其對T細胞功能的影響，可揭示胃癌患者免疫抑制的機制，從而干擾T細胞的免疫抑制狀態(tài)，這可能是胃癌治療的新方向。

Yu等[38]建立了胃癌的裸鼠模型，并將Tim-3刺激的T細胞注射到小鼠中，以評估腫瘤的生長，結果發(fā)現(xiàn)，與外周血相比，癌旁組織和癌組織中T細胞表面的Tim-3表達水平均顯著升高；與癌旁組織相比，癌組織中T細胞表面的Tim-3表達水平也顯著升高，表明T細胞表面Tim-3的表達水平與胃癌T分期呈正相關。Tim-3可能通過抑制T細胞分泌腫瘤壞死因子-α和γ干擾素使T細胞功能降低，進而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。另外，Cheng等[39]通過流式細胞術評估胃癌標本和胃炎組織中Tim-3的表達水平發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中Tim-3的表達水平顯著高于胃炎組織；且CD8+T細胞中Tim-3的表達與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、浸潤深度、組織學類型均無關，僅與TNM分期有關。由此可見，Tim-3可引起T細胞功能障礙或活性降低，負調節(jié)免疫應答，與胃癌預后呈負相關，其在細胞上的表達水平是胃癌患者的獨立預后因素。

2.3PD-1 PD-1屬于CD28蛋白家族，可在T細胞、B細胞、NK細胞和DC等多種免疫細胞表面表達，在腫瘤免疫逃逸過程中發(fā)揮關鍵作用，其機制主要為：效應T淋巴細胞通過T細胞受體與腫瘤細胞中主要組織相容性復合體間的相互作用識別腫瘤細胞；在激活免疫應答后，腫瘤能夠在腫瘤細胞表面表達PD-L1，隨后PD-L1與PD-1結合，關閉免疫反應使腫瘤細胞逃脫死亡[20]。

目前已知PD-1與T細胞功能的抑制有關[24,40-41]。有學者研究了胃癌患者T細胞表面PD-1分子的表達和功能，發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血和癌組織中T細胞表面PD-1的平均表達水平顯著升高，表達PD-1的T細胞分泌干擾素的能力顯著降低[24,40]。另有研究證明，PD-1或PD-L1在胃癌患者的腫瘤細胞中高表達[42-44]。Deng等[45]在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，當PD-L1在慢性發(fā)炎的組織和腫瘤中表達時，對T細胞具有負調節(jié)作用的PD-L1的治療性阻斷可以增強T細胞效應子的功能。另外，放療和抗PD-L1藥物協(xié)同治療可減少腫瘤浸潤性髓樣來源的抑制細胞的局部積累，從而抑制T細胞并改變腫瘤免疫微環(huán)境。有學者通過免疫組織化學方法研究了PD-1和PD-L1在胃癌患者的表達水平，發(fā)現(xiàn)53.8%的胃癌患者PD-1表達陽性(主要限于TIL)，30.1%的胃癌患者PD-L1表達陽性[46]。盡管PD-1和PD-L1在胃癌中的表達與預后密切相關，但結果仍不一致[47]。Zhang等[48]通過薈萃分析評估了PD-L1在胃癌中的預后價值，通過對1 901例患者的研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1的表達與腫瘤大小及淋巴結狀態(tài)相關，但與性別、年齡、癌癥位置、分化、浸潤深度及腫瘤分期無關；同時他們還指出，腫瘤內的PD-L1大多與胃癌患者的無進展生存期密切相關，這為PD-L1靶向治療胃癌患者提供了有利證據，并推測PD-1或PD-L1的特異性抑制劑可能是影響多種胃癌的潛在治療候選物。目前已經開發(fā)了幾種針對抑制PD-1或PD-L1途徑的治療性抗體，如一種針對PD-1的人源化免疫球蛋白G4單克隆抗體，可用于PD-L1陽性的復發(fā)性或轉移性胃或食管胃腺癌患者，目前正在進行臨床試驗。

3 TIL的分布與胃癌的關系

在TIL與胃癌關系的研究中，不同淋巴細胞亞群的數(shù)量、功能與預后之間的關系是目前最主要的關注點。TIL可以滲入基質和腫瘤細胞，因此可分為腫瘤內TIL和基質TIL。腫瘤內TIL在癌巢上皮組織內直接與腫瘤細胞接觸，且細胞之間無間質組織；基質TIL分布于腫瘤細胞間的間質內，不與腫瘤細胞接觸；腫瘤內TIL的絕對數(shù)量較少、存在的區(qū)域范圍小、分布的異質性明顯，且不易通過蘇木精-伊紅染色觀察；而基質TIL數(shù)量相對較多，易于觀察評價，且癌巢密度、形態(tài)等變化對基質TIL影響較小[49]。以往對胃癌中TIL的研究已經評估了基質和腫瘤內淋巴細胞，其中標準蘇木精-伊紅染色切片的視覺評估是最常用的測量TIL的方法[50-51]。基于使用蘇木精-伊紅染色的載玻片對TIL的組織病理學分析，Kang等[52]提出，基質TIL可定義為包含浸潤性單核炎癥細胞的腫瘤基質區(qū)域，而腫瘤內TIL可定義為腫瘤細胞內的上皮內淋巴細胞或單核細胞。這表明，基質TIL可用于預測無復發(fā)生存期和無進展生存期。另一項研究發(fā)現(xiàn)，增加腫瘤內TIL與改善癌癥特異性生存顯著相關[53]。事實上，基質TIL在乳腺癌中被認為是一個優(yōu)越、可重復的參數(shù)[51]。盡管如此，目前對于TIL分布與胃癌預后的關系尚無共識，且研究胃癌患者TIL分布的方法還需要標準化。

4 小 結

胃癌內的Treg細胞、Th17細胞、Th22細胞、CD57、Tim-3以及PD-1通常與不良預后相關，而高比值的Th1/Th2、CD8、CD45RO+T細胞通常與良好預后相關。TIL在胃癌的預后方面發(fā)揮重要作用，是胃癌患者潛在的生物標志物和良好預后的準確預測因子。另外，腫瘤組織及其周圍組織的免疫反應與患者預后密切相關。相信隨著更精確的免疫浸潤分析方法的發(fā)展，不同的淋巴細胞亞群的代表意義將越來越清楚。特別是對于富含TIL的腫瘤來說，TIL可以作為治療腫瘤的重要生物標志物，這有助于未來靶向免疫細胞的常規(guī)療法和新療法的研究。因此，了解TIL對胃癌的作用機制，預示著個性化治療的新機遇。