透射電鏡樣品取材和固定應注意的若干問題*

周晨明 朱 艷 孟 麗 閆 靜 徐彥楠

河北醫科大學 1 電鏡實驗中心 2 教學實驗中心，河北省石家莊市 050017

電子顯微鏡技術廣泛應用于科研和醫療中，在日常的工作過程中經常會出現學生送的標本因取材或固定不當而影響最終超微結構的觀察。取材固定是電鏡樣品制備的第一步，也是最關鍵的一步，直接影響觀察結果。所以在此筆者對經常出現的問題進行分析總結。

1 取材前的準備工作

1.1 實驗設計 大量閱讀文獻，明確實驗目的，設計實驗流程，合理安排取材時機[1]。戊二醛影響抗原性，若課題需要做免疫性的實驗，就必須每組單獨準備一只做電鏡的動物。對于未進行灌流固定的動物最好先進行電鏡標本的取材，以免組織自溶，影響超微結構的觀察。實驗動物要避免刺激以及環境的改變，盡量保持其生理狀態，增加實驗的可比性和可靠性[2]。取材時，務必做到相同條件下取材，相同人員平行操作，分別平行取每一組相同序號的動物[3]。一般每組動物至少取3份標本，避免個體差異，增加結論的可靠性。

1.2 固定液的選擇 固定的作用是在分子水平上使細胞保存生活狀態的超微結構，減少細胞死后的變化。化學固定劑可以和蛋白質結合形成交聯，將蛋白質固定下來，也可以將糖、脂肪等物質保存在生存時的狀態和位置，因此固定液的選擇極為重要。

取材后固定的操作由學生進行，固定液的選擇至關重要。一般細胞固定液為2.5%的戊二醛，組織固定液為4%的戊二醛，灌流固定選用3%多聚甲醛1%戊二醛，固定液應為清澈透明的液體，若見白色渾濁或絮狀物則固定液不合格，影響最后的固定效果。固定液的酸堿度可以引起組織pH值的變化，不僅可以從根本上改變蛋白質等大分子物質的結構和性質，而且還會影響細胞質的化學成分、膜的大分子排列及酶的生物活性，所以固定液的酸堿度必須與被固定的組織酸堿度基本一致[4]。大多數動物組織酸堿度的平均值是7.4，所以固定液的pH值必須在7.2～7.4之間。

1.3 實驗器械、標本固定容器的準備 固定組織的容器最好為青霉素小瓶，不宜使用Eppendorf 管，因為青霉素小瓶的底面比較大，組織可以充分地與固定液進行接觸，固定效果更好。對取材用器材及試劑，進行清潔及預冷，寫好取材的標簽。

2 取材

2.1 正常對照組的取材 正常對照組應與模型組、治療組同時取材。在工作中經常出現先用空白對照組進行練手，以致其結構變化，最終導致無法作為正常對照組。

2.2 組織標本的取材原則 組織標本的取材遵循快、小、輕、準、冷五原則。快：要求組織在斷血1min內浸入固定液。取材時間過長，會出現細胞內溶酶體膜破裂，組織自溶。在操作過程中必須目標明確動作迅速，若多部位取材，須多人配合。小：沒有方向的組織一般為取材尺寸為1mm×1mm×1mm，有方向的組織為1mm×1mm×3mm為宜，3mm為長軸的方向。因為固定液的穿透能力只有0.5mm，若樣品過大會使內部固定不良；但也不能太小，樣品過小時觀察的目標將受到局限。輕：取材刀片要鋒利，多選用雙面剃須刀片，操作應始終貫徹動作輕柔。只做直線切割，避免對組織的擠壓及拉鋸，以免引起的組織結構的人工損傷性變化。準：部位準確可靠，根據研究目的要考慮到定位和定向的問題。冷：低溫下操作，低溫下保存，低溫下送樣。為了降低水解酶的活性，盡量在低溫下操作，所用容器和器械應預冷，取好的標本放在4℃冰箱保存。送樣時最好放到冰盒里，但應注意在小瓶與冰之間應用紗布隔開，以免固定液結冰，破壞細胞結構。

2.3 取材具體操作 將動物急性處死(或麻醉)，暴露出所需要的器官，用鋒利的解剖剪剪取一小塊組織，放在預先預冷的4%戊二醛固定液中。然后取出放在下面鋪有冰袋的蠟板上，滴1滴預冷的固定液，用雙面刀片將材料切成大約1mm寬，2～3mm長的小條，剪刀剪過的部位盡量不保留，對于沒有定向要求的標本再將其切成約的1mm3小塊。最后用牙簽將組織塊逐一放入固定液的小瓶中。放入4℃冰箱，固定2～4h。若不能及時往電鏡室送樣，每周更換固定液，放置最好不要超過2周。

2.4 特殊部位的取材 腦：因對缺氧比較敏感，所以最好先進行灌流固定，待組織硬化后進行取材。視網膜：常規的取材方法易造成視網膜組織脫離、皺褶，不符合電鏡觀察的要求。應該灌流固定后取整個眼球，將角膜剪開用注射器注入固定液，再將整個眼球放入固定液中固定。管狀組織：取1cm左右的一段，再將兩端上翻的組織用雙面刀片去除，再進行固定。睪丸：因白膜下均為精曲小管，若取材太小則容易散開，所以取材應大一點，待固定一段時間后再進行修塊，去除白膜，取白膜下的部分再進行固定。胰島：若觀察胰島，取材應在胰腺的胰尾部。肺：因肺密度較小，固定時經常漂在上面，可以用小紗布將其包裹，再放入固定液中即可下沉。腎：若觀察腎小球，應選擇腎皮質部位進行取材。

2.5 培養細胞的取材固定 收集細胞的數量因細胞體積的大小而定，一般(2～5)×106即可。收集懸浮細胞時，將含有細胞的培養液倒入離心管，進行離心。貼壁細胞先將細胞從培養瓶或培養皿上輕輕地刮下來或者用胰酶消化下來，收集到離心管中離心。如果觀察細胞凋亡，則應注意凋亡細胞或凋亡小體主要漂浮在培養液中，在收集樣品過程中不能將培養液全部棄掉，應該將刮下的細胞和培養液中的細胞一同離心固定[5]。若僅保留貼壁細胞，將很難找到理想的凋亡細胞。

為了獲得更理想的超微結構，可在離心前加入等量的2.5%的戊二醛，再進行離心。不同細胞離心轉速和時間不同，應查閱文獻進行確定。棄上清后沿管壁緩慢加入固定液，在4℃冰箱內靜置固定1～2h，然后送樣。若固定后，在送樣時又散開，且再次離心不易成團，可以棄固定液，加入小滴10%牛血清白蛋白，再離心成團，再棄上清加固定液送樣。

3 討論

在多年電鏡工作中發現，學生在做電鏡實驗中準備不充分，沒有閱讀文獻，對自己實驗目的不明確，前期實驗設計不合理、取材操作不規范，導致后續工作都是徒勞。所以，作為電鏡工作人員要做好前期的教學、幫助學生進行實驗設計、指導取材等工作。身為學生，在電鏡實驗過程中，務必做到虛心學習、多查、多問、多思考、多練習，以使實驗順利完成。