NF-κB/iNOS-NO信號轉導通路的臨床研究進展*

史丙科 李守林

中國醫科大學深圳市兒童醫院,廣東省深圳市 518038

1980年Furchgott等發現血管內皮細胞可合成并產生血管內皮舒張因子(EDRF),隨后Palmer等研究其化學本質為一氧化氮(NO)，在呼吸、心腦血管、神經、免疫調節等領域起到重要的生物學作用。誘導型一氧化氮合酶(iNOS)目的基因啟動子κB序列位點(GGGACTTCC)被內毒素、細胞因子、炎癥因子、活性氧(ROS)所激活從而上調表達產生大量致病性NO，高濃度的致病性NO是一種氮自由基(RNS)，可引起DNA氧化損傷、炎癥反應和細胞凋亡[1]。本文從iNOS的結構和功能出發，闡述其對核轉錄因子NF-κB及NO的影響，并簡單綜述NO與臨床疾病的關系。

1 iNOS的結構及功能

一氧化氮合酶(NOS)分布于生物體內各種細胞，大致分為組成型一氧化氮合酶(cNOS)和iNOS，其中cNOS又分為神經型一氧化氮合酶(nNOS)和內皮型一氧化氮合酶(eNOS)，目前可以用序號命名NOS，即NOSⅠ/Ⅱ/Ⅲ，分別替代nNOS，iNOS和eNOS[2]。iNOS在細胞中通常不表達，但可以由細菌脂多糖(LPS)、細胞因子和其他因子誘導，主要在巨噬細胞中發現，只要確定了合適的誘導劑，酶的表達幾乎可以在任何細胞或組織中被刺激，并且一旦表達，iNOS就會持續活躍，不受細胞內Ca2+濃度的調控。iNOS的調控主要在轉錄水平產生重要介質NO。近年來，多種研究表明，iNOS是NF-κB介導的重要調控因子，與免疫應答、氧化損傷及炎癥反應有著密切的聯系[3]。

2 NF-κB與iNOS基因

30余年前，Sen和Baltimore通過研究發現核因子NF-κB可以與多種基因序列中的啟動子和增強子發生特異性結合，進而啟動基因轉錄調控進程，并在細胞免疫及炎癥相關反應參與疾病的發病過程中發揮重要作用。核因子NF-κB，是細胞中重要的轉錄因子，NF-κB家族有NF-κB1(p50及前體p105)、NF-κB2(p55及前體p100)、相關因子A(RelA)、核因子c-Rel及相關因子B(RelA)5個成員組成。P50/p65NF-κB二聚體能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強子κB基序(GGGACTTTCC)結合；RelA/c-Rel二聚體，能與靶基因增強子的κB基序結合。研究發現[4]，NF-κB信號激活通路主要有三種：炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α/IL-1/丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)/LPS等激活的經典通路；B細胞中，LT-β/TNF家族成員TALL-1受體(BAFF-R)、B細胞腫瘤壞死因子激活因子(BAFF)BAFF-R、CD40L/CD40、Blys/LT-βR可誘導非經典信號通路活化；適當水平ROS活化PTK使IκBα(NF-κB抑制蛋白)磷酸化降解，以及糖原合成酶激酶(GSK)-3β、磷酸化P65等組成的其他通路。

iNOS基因在轉錄水平表達。最近，有研究發現在結核分枝桿菌PPE家族成員PPE2蛋白有一個亮氨酸拉鏈DNA結合基序,可能與鄰近iNOS基因啟動子TATA盒的GATA-1-binding寡核苷酸近端特異性盒濃度依賴性結合，此為iNOS基因轉錄重要組成部分[5]。根據研究表明，人iNOS基因啟動子與鼠類iNOS基因啟動子序列結構類似，說明NF-κB也參與人iNOS基因的轉錄調控[6]。

3 NF-κB/iNOS-NO信號轉導通路

NF-κB信號轉導通路存在于多種生物體細胞的免疫、抗凋亡、炎癥反應及增殖分化反應中，而iNOS和NO是NF-κB信號轉導通路中重要的兩種信號轉導分子[7]。iNOS基因的啟動子序列含有κB位點(GGGACTTTCC)，與NF-κB特異結合，從而啟動基因的轉錄，產生大量NO。NO的化學性質不穩定，半衰期過短，在負氧離子存在時易失活，而存在超氧化物歧化酶(SOD)和酸性pH條件時相對穩定。NO可調節NF-κB水平:生理性NO能減輕中性粒細胞的毒性作用，抑制核因子NF-κBp65向核移位，抑制黏附分子表達，下調相關黏附分子水平，保護血管壁完整性，生理性NO本身能作為NOS的負反饋抑制劑，使NF-κB水平上升，NF-κB/iNOS-NO信號通路活化，抗凋亡。相反，在高水平致病性NO作用下，抑制IκB磷酸化及降解，可使NF-κB的抗凋亡活性被抑制；內源性生理性NO部分與氧結合形成過氧化亞硝酸陰離子 (ONOO-)，進而引起脂質過氧化，損傷內皮細胞功能，還有部分與體內半胱氨酸殘基(有巰基)的蛋白/谷胱甘肽(GSH)等反應，生成硫化亞硝基蛋白/硫化亞硝基硫醇，硫化亞硝基硫醇在酸性PH條件下釋放的NO隨呼出氣體排出體外[8]。高水平致病性NO可與線粒體呼吸鏈中呼吸鏈復合物Ⅰ/Ⅱ、DNA合成酶、DNA連接酶等的Fe-S基團結合，破壞它們的活性，產生細胞毒作用；能通過cADP-核糖通路激活NAD葡萄糖水解酶、CD38樣雙功能酶、ADP核糖轉移酶和水解酶、多聚(ADP-核糖)合成酶等，產生細胞毒作用，使細胞凋亡。過量的致病性NO通過Cox2(環氧合酶-2)可促使中性粒細胞和淋巴細胞增殖，產生iNOS,又大量產生NO,入血后結合亞鐵血紅素的Fe2+，形成大量亞硝酰基鐵，損傷血紅蛋白對氧的運輸、細胞呼吸、能量代謝等，促進炎癥反應的發生[9]。

4 NO與臨床的關系

4.1 NO與呼吸系統疾病 NO在呼吸系統調節氣道和血管平滑肌、黏液轉運以及肺發育、肺損傷中起到重要作用，適量的生理性NO對人體產生正向保護作用，但過量致病性NO具有細胞毒作用[10]。氣道在炎癥情況下，TNF-α可誘導氣道上皮細胞iNOS基因持續表達，進而產生大量致病性NO,引起炎癥反應，增加氣道通透性導致滲出和水腫。致病性NO與炎癥細胞產生的O2-,可生成過氧亞硝酸鹽，使氣道發生炎性損傷[11]。肺纖維化由肺成纖維細胞分泌的膠原纖維增生聚集導致結構重塑，肺泡巨噬細胞異常活化iNOS釋放大量致病性NO，導致肺成纖維細胞大量增生并分泌膠原分子，最終引起肺纖維化。目前，抑制iNOS-NO通路，可明顯改善肺纖維化。有研究發現，在肺癌患者中，高/低水平NO與患者的晚期或者較差的生存率有關，持續中等水平NO可促進肺癌細胞轉移中的侵襲作用。NO依賴性的炎癥細胞浸潤及IgG、IgA免疫復合物可引起急性肺損傷，給予硝普鈉促進生理性NO適量增加，肺水腫可明顯減輕，NO還可抑制NADOH氧化酶產生O2-,減少多形核細胞對血管內皮細胞的黏附及肺部的浸潤[12]。接觸職業性暴露因素二氧化硅等可引起肺巨噬細胞和上皮細胞iNOS表達產生大量致病性NO，誘發肺部組織炎癥反應，了解其發病機制，有助于增強對肺部職業疾病的預防和調控,因此，可通過應用抑制劑來保證NO處于正常生理水平，或許可以成為治療肺部纖維化相關疾病的新藥靶點。

4.2 NO與心血管系統疾病 NO是幾種最常見心血管疾病的危險因素之一。硝酸甘油在臨床上治療心血管疾病已經有150多年的歷史，直到20世紀70年代末，其作用成分被證實為NO。生理性NO可以調節血管張力，促使冠脈擴張增加側支循環，增加對心肌的保護作用；致病性NO，可經cGMP/PKG通路上調NF-κB/TNF-α,TNF-αK可刺激產生iNOS進而產生大量NO，在冠心病、高脂血癥患者血管內，促進氧化應激，可引起脂質、DNA、蛋白質的過氧反應產生細胞毒作用，進而發生炎癥反應、功能失常、器官衰竭等改變[13]。高水平持續病理性NO可降低心肌細胞收縮力，引起心肌功能障礙。目前部分研究已證實NO與心血管系統存在緊密聯系，通過抑制NF-κB/iNOS-NO信號轉導通路，可能為臨床提供新的科研方向。

4.3 NO與消化系統疾病 低水平NO可降低因應激、藥物等引起的氧自由基減少到最后的胃黏膜損害，NO可通過維持胃黏膜組織氧合作用來保證HCO3-以及相關營養物質的運輸并且加速有毒物質的清除。作為重要的神經遞質，幽門括約肌及oddi括約肌等均受NO的調控，故對胃腸動力起到重要作用。幽門螺旋桿菌激活NF-κB/iNOS-NO信號通路導致慢性萎縮性胃炎。Rashed等[14]研究發現消化性潰瘍患者與對照組相比NO含量下降，胃酸分泌的能力及胃黏膜保護作用降低。研究發現iNOS誘導產生的NO在抵抗病菌感染方面同樣發揮重要的作用，NF-κB、TNF-α、IL-17A、IL-8、INF(干擾素)-γ可刺激炎癥細胞表達iNOS產生致病性NO，引起結腸組織水腫、充血以及功能障礙[15]。IL-6可通過NF-κB/iNOS-NO信號通路激活肝星狀細胞，進而增生和分泌細胞外基質參與肝纖維化的形成和肝內機構的重建。基于上述研究，NF-κB/iNOS-NO信號通路是引起消化系統炎癥反應的作用機制之一。

4.4 NO與泌尿系統疾病 NO在腎組織損傷的作用有雙重性，早期腎組織nNOS、eNOS合成NO，其擴血管，抑制血小板聚集大大保護腎組織損傷，在晚期，系膜和腎小管上皮細胞產生的NO可能加劇損傷，部分原因是這些細胞被炎癥因子刺激后iNOS表達，從而加重腎損傷[16]。NO主要調節腎血流動力學及腎小球微循環，Kiyotaka Mukai等研究在麻醉小鼠NO抑制劑L-NAME可增強血管收縮并伴有腎功能不全。膀胱癌患者中NO等氧化劑含量較高，提示氧自由基在膀胱癌中發揮重要的作用。脊髓損傷可導致逼尿肌—外括約肌協同障礙，從而引起膀胱出口梗阻，研究表明，增加NO供體引起其在尿道濃度增高可減輕尿道壓力,這種治療方式可在一定程度緩解脊髓損傷帶來的膀胱出口梗阻問題[17]。近些年，NO與神經源性膀胱的關系成為研究熱點，但其具體作用機制尚未明了，通過建立膀胱出口梗阻動物模型，選擇性抑制NF-κB/iNOS-NO信號轉導通路靶點，可以提供新的治療策略。

4.5 NO與神經系統疾病 中樞神經系統氧化應激時，神經細胞內氧化作用增強，抗氧化作用減弱，ROS及活性氮(RNS)水平明顯上調，引發過氧化反應、硝基化反應，可能使細胞的蛋白質、核酸、脂質以及細胞因子被損傷，進而引起炎癥、異常收縮及細胞凋亡[18]。而高水平致病性NO產生原因有：一是大量乙酰膽堿、緩激肽的刺激；二是IL-1、TNF-α、INF-γ水平明顯上調；三是細胞質鈣離子、脂多糖、內毒素等水平明顯上調；此時腦血管內皮細胞，膠質細胞、巨噬細胞、中性粒細胞產生大量iNOS、NO、ROS、RNS。高水平NO還會導致腦源性神經營養因子分泌的下調，而腦源性神經營養因子對神經元的存活、發育和分化、突觸形成以及學習和記憶至關重要。阿爾茨海默病(AD)是一種典型的中樞神經系統退行性病變，少突膠質細胞(OLS)是中樞神經系統中的髓鞘形成細胞，髓鞘損傷可能與AD的認知功能障礙有關，研究表明一氧化氮(NO)作為一種信號分子，可能通過單羧酸轉運蛋白1(MCT1)影響能量傳輸機制進而對軸突和髓鞘產生作用[19]。帕金森病時過高水平致病性NO、ROS、RNS參與毒物1甲基4苯基1236四氫吡啶(MPTP)引起腦酪氨酸羥化酶的硝基化失活，下調多巴胺水平，過高水平致病性NO激活多聚(ADP-核糖)聚合酶，阻斷DNA修復并損傷神經細胞。通過選擇性實用NOS抑制劑，如L-精氨酸類似物、糖皮質激素、抗氧化劑、前列腺素E2能抑制NOS合成，保護多巴胺神經元，也可以擴張腦血管，增加腦血流量[20]。

但是臨床疾病成因及發展機制相對復雜，各個信號通路相互影響，單純抑制NF-κB/iNOS-NO信號通路效果一般，隨著研究的深入，對部分疾病作用機制的認識越來越全面，因此，掌握NF-κB/iNOS-NO信號通路具體作用機制，會對未來臨床實踐產生深遠的影響。