PD-1與PD-L1在結直腸癌的研究現狀

廖世民，范晶，王子衛，何苗

(1.重慶大學附屬腫瘤醫院 重慶市腫瘤研究所 重慶市腫瘤醫院胃腸腫瘤中心，重慶 400030 2.重慶醫科大學附屬第一醫院a.急診科b.普通外科，重慶 400016)

腫瘤是嚴重威脅人類健康的一類疾病，伴隨人口老齡化，其發病率和患病率呈上升趨勢[1]。當前實體腫瘤的治療采用以手術為主，化療、放療、靶向治療、中醫藥治療為輔的綜合治療，但療效欠佳。免疫治療是近年腫瘤治療領域的新熱點[2]。2018年諾貝爾生理學或醫學獎也授予了研究腫瘤免疫治療的美國和日本科學家，人類治療腫瘤的觀念也發生改變。程序性細胞死亡受體-1(programmed cell death-1，PD-1)、程序性細胞死亡配體-1(programmed cell death ligand-1，PD-L1)及其抑制劑是腫瘤免疫治療的研究熱點。PD-1常存在于免疫細胞表面，與其配體PD-L1結合后產生負反饋信號，抑制免疫功能。此功能作為保護機制使宿主免受自身免疫系統的錯誤攻擊，但部分腫瘤細胞也可能利用此機制(過表達PD-L1)逃避免疫系統監控。PD-1/PD-L1抑制劑的作用是阻止負向反饋信號，激活免疫細胞對腫瘤細胞的監控。結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是十分常見的消化道惡性腫瘤，其發病率在我國部分地區僅次于肺癌，已成為第二大瘤種[3]，當前其免疫治療尚處于探索階段。現總結腫瘤免疫治療的基礎理論，介紹PD-1/PD-L1在CRC中的研究進展。

1 腫瘤免疫監控與逃逸

人體免疫系統的一項重要功能是識別和清除腫瘤細胞，即腫瘤免疫監控。此過程涉及3種免疫細胞：①抗原提呈細胞，以樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)為代表，其功能是識別和攝取腫瘤產生的腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen，TAA)，然后提呈給T淋巴細胞；②T淋巴細胞，被DCs激活，識別并攻擊、清除產生TAA的腫瘤細胞；③B淋巴細胞，產生針對TAA的特異抗體。其他免疫調節細胞包括自然殺傷細胞、巨噬細胞、T調控細胞等。這些細胞與腫瘤周圍基質細胞一起構成腫瘤免疫微環境，共同參與腫瘤免疫監控[4-5]。

雖然機體存在抗腫瘤免疫監控，但腫瘤細胞也存在逃逸免疫識別的機制。此機制可概括為：①部分清除(腫瘤細胞清除不完全)；②維持平衡(腫瘤細胞處于休眠或靜息狀態，但積累著遺傳學和表觀遺傳學變異)；③逃逸增殖(腫瘤細胞已耐受機體的免疫監控，并逃逸免疫攻擊)。逃逸免疫識別的機制由抑制T細胞免疫的檢查點蛋白調控，包括細胞毒T淋巴細胞相關蛋白4、PD-1、PD-L1、淋巴細胞激活蛋白3等[6]。由于免疫檢查點抑制T細胞免疫，腫瘤細胞可利用免疫檢查點抑制T細胞的免疫攻擊，當前觀點認為部分腫瘤組織PD-1/PD-L1的表達顯著增強。

2 PD-1/PD-L1與腫瘤免疫

PD-1是免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，主要在T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞、DCs、巨噬細胞的胞膜表達，而其配體PD-L1通常在腫瘤細胞表達,亦可在激活的T細胞和巨噬細胞表面表達。PD-L1與PD-1結合后可抑制T細胞增殖、分化以及分泌細胞因子。因抑制了T細胞的活性，T細胞的腫瘤免疫監控作用受損，導致腫瘤免疫耐受和逃逸[7]。

目前認為PD-1/PD-L1高表達可能與部分腫瘤預后不良相關，其高表達也是預測腫瘤抗PD-1/PD-L1免疫治療療效的標志之一[4-7]。研究發現，抗PD-1/PD-L1治療對部分實體腫瘤療效較好，這部分腫瘤的錯配修復功能異常(mismatch repair deficiency，dMMR)導致了高度微衛星不穩定(microsatellite instability-high,MSI-H)，dMMR產生的大量變異腫瘤抗原誘導免疫細胞大量浸潤(腫瘤免疫治療的基礎)[6-7]。腫瘤細胞激活免疫檢查點信號如PD-1/PD-L1等抑制了T細胞免疫攻擊，故針對免疫檢查點的抑制劑如PD-1/PD-L1抑制劑Pembrolizumab，可通過激活T細胞的免疫攻擊實現抗腫瘤的作用[8]。故腫瘤MMR狀態以及PD-1/PD-L1的表達水平對判斷免疫治療效果至關重要。

不少抑制PD-1/PD-L1的單克隆抗體已經上市，并用于不同惡性腫瘤的免疫治療，如轉移性黑素瘤、非小細胞肺癌、腎癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤等。相對于其他免疫治療，PD-1/PD-L1抑制劑的抗腫瘤療效(包括有效率和持續時間)更顯著，且毒副作用更小。

3 CRC的免疫微環境

在CRC中，相對于錯配修復功能正常(mismatch repair-proficient,pMMR)/微衛星穩定(microsatellite stable,MSS)的CRC，dMMR/MSI-H-CRC具有更積極的免疫微環境，CD8+和CD4+T淋巴細胞浸潤腫瘤組織更明顯[8]。在dMMR/MSI-H-CRC中，腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)的密度是pMMR/MSS-CRC的10～50倍[9]。但即使在如此積極的免疫微環境中，dMMR/MSI-H-CRC也未被免疫清除。一項研究分析了CRC細胞、TIL細胞、巨噬細胞的PD-L1表達情況后發現，dMMR/MSI-H-CRC組織高表達PD-L1，且主要在TIL等免疫細胞表達，并非是CRC癌細胞，這與黑色素瘤、腎癌、肺癌的PD-L1主要在癌細胞表達不同，而MSS-CRC幾乎不表達PD-L1[8]。提示MSI-H-CRC可能通過增強PD-1/PD-L1信號通路抑制免疫監控，導致腫瘤的免疫耐受和逃逸。基于此，MSI-H-CRC可能是抗PD-1/PD-L1免疫治療的候選疾病。

Cantero-Cid等[10]發現，CRC組織中存在大量CD14+單核巨噬細胞和CD4+淋巴細胞浸潤，其中單核巨噬細胞表達PD-L1(腫瘤細胞并無PD-L1表達)，淋巴細胞表達PD-1。提取CRC患者外周血中的單核細胞、淋巴細胞與患者的癌細胞進行共培養，可誘導CD14+細胞表達PD-L1，導致T淋巴細胞衰竭，而使用PD-1抗體可恢復淋巴細胞增殖[10]，這也證實了CRC免疫微環境的特點。

4 CRC中PD-1/PD-L1的基礎研究

4.1PD-1/PD-L1與表觀遺傳 表觀遺傳是指不涉及DNA序列改變的，并可隨細胞分裂而遺傳的基因組修飾和調節，DNA甲基化和微RNA是其中的重點。在CRC中作為癌基因的PD-L1可能受DNA甲基化和微RNA的調節。Elashi等[11]發現，CRC患者外周血中PD-L1顯著升高，且PD-L1基因啟動子存在異常DNA低甲基化，低甲基化程度與PD-L1升高程度密切相關。提示CRC患者PD-L1的表達可因DNA的異常低甲基化而增強，并認為抗PD-L1聯合去甲基化抑制劑治療CRC可能更有效。此外，Ashizawa等[12]研究發現，dMMR/MSI-H-CRC中的miR-148a-3p可直接與PD-L1的3′非編碼區結合，并抑制PD-L1的表達。但miR-148a-3p在dMMR/MSI-H-CRC中的表達降低(與PD-L1高表達負相關)，若在T淋巴細胞和結腸癌細胞共培養模型中過表達miR-148a-3p，則可抑制癌細胞表達PD-L1，進而減少T細胞凋亡[12]。提示miR-148a-3p負向調節CRC細胞表達PD-L1，miR-148a-3p的減少將導致PD-L1表達的增強，進而導致腫瘤細胞的免疫逃逸。

4.2PD-1/PD-L1與結腸癌干細胞 腫瘤干細胞是一種具有自我復制、自我更新和多向分化能力的腫瘤細胞，這類細胞具有成瘤能力，是腫瘤細胞增殖和形成轉移瘤的基礎。結腸癌干細胞的功能可能與PD-1/PD-L1的表達相關。Wei等[13]發現，CD133+CD44+的結腸癌干細胞高表達PD-L1，PD-L1通過增強“干性”基因的表達促進細胞自我更新；且體內外耐化療藥的結腸癌干細胞PD-L1的表達均顯著增強；PD-L1還可增強結腸癌干細胞在裸鼠上的成瘤率。PD-L1可能是通過上調高遷移族蛋白A1(high mobility group AT hook 1,HMGA1)，激活HMGA1介導的磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信號調節激酶信號通路，導致結腸癌干細胞擴增；相反，下調HMGA1可抑制PD-L1導致的腫瘤干細胞擴增，突顯了HMGA1在PD-L1介導的結腸癌干細胞自我更新中的重要作用[13]。此外，PD-L1的表達與腫瘤干細胞標志物以及HMGA1的表達呈正相關[13]，所以PD-L1可通過激活HMGA1介導的信號通路維持結腸癌干細胞的自我更新。

4.3PD-1/PD-L1與MMR基因 MMR基因是從遺傳性非息肉性大腸癌中分離出來的遺傳易感基因，該基因突變會導致細胞錯配修復功能缺陷，表現為復制錯誤或MSI，從而導致腫瘤發生。遺傳性非息肉性大腸癌是MMR基因發生胚系突變所致的單基因顯性遺傳病，又稱Lynch綜合征，在部分MSI的散發CRC中也存在MMR基因突變。CRC中MMR基因的功能狀態與PD-L1關系密切。Ahtiainen等[14]研究發現，PD-L1在癌細胞和免疫細胞中的表達重合率很高，在dMMR-CRC中，不論是癌細胞還是免疫細胞，PD-L1和PD-1的表達均顯著強于pMMR-CRC。Liu等[15]比較pMMR-CRC與dMMR-CRC發現，dMMR-CRC組織中淋巴細胞浸潤和PD-L1的表達均較pMMR-CRC更顯著，并認為dMMR-CRC對免疫治療敏感的原因是淋巴細胞浸潤和PD-L1陽性表達。

Droeser等[16]發現，在pMMR-CRC中PD-L1也有一定程度的表達，且PD-L1的表達與CD8+淋巴細胞浸潤、較早的T分期(腫瘤浸潤腸壁深度)、無淋巴結或血管轉移、更低的腫瘤分級、更好的預后等相關，因而pMMR-CRC中PD-L1的高表達可能是CRC預后較好的指標之一。Smith等[17]認為，對pMMR-CRC使用抗PD-1治療也能獲益，并認為T細胞對致瘤性基因突變的反應是普遍性。綜上，PD-1/PD-L1在dMMR/pMMR-CRC中均有表達，但在dMMR-CRC中可能更顯著。

5 CRC中PD-1/PD-L1的臨床研究

5.1PD-1/PD-L1與CRC預后 PD-1/PD-L1與CRC預后的關系尚有爭議。Li等[18]研究發現，高表達PD-L1與CRC患者總生存期縮短、無進展生存期縮短、腫瘤分化更低等相關，但與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分級分期、淋巴轉移等無關。提示PD-L1高表達可能是CRC預后不良的分子標志物，也是臨床采用抗PD-1/PD-L1治療的依據。Shen等[19]認為，PD-L1高表達與CRC預后不良關系密切，且PD-L1高表達與CRC的淋巴結轉移和腫瘤高分期相關。

但Li等[20]研究發現，PD-1/PD-L1的高表達與CRC相對較好的預后相關，特別是對于pMMR-CRC患者，這與Droeser等[16]的研究結果相近。Berntsson等[21]利用免疫組織化學研究發現，若結腸癌(包括左半、右半結腸癌)組織中浸潤的免疫細胞高表達PD-L1，或右半結腸癌(除外左半結腸癌、直腸癌)中浸潤的免疫細胞高表達PD-1，則患者的5年生存率更高，而癌細胞表達的PD-L1與CRC預后無關。Hamada等[22]發現，結腸癌組織中浸潤的淋巴細胞若表達PD-L1則與腫瘤明顯的MSI、高程度CpG島甲基化、BRAF基因突變、腫瘤抗原升高等因素密切相關，但PD-1、PD-L1的表達與結腸癌預后并無顯著關聯。綜上，PD-1/PD-L1與CRC預后的關系仍有待探索。

5.2放化療與PD-1/PD-L1 放化療是除手術外CRC最重要的治療方式。Tominaga等[23]采用酶聯免疫吸附法研究117例低位直腸癌患者放化療前后血漿游離PD-1/PD-L1的水平發現，PD-L1在放化療后明顯升高，但PD-1變化不明顯。Roxburgh等[24]研究了8例Ⅱ、Ⅲ期直腸癌患者發現，采用FOLFOX(奧沙利鉑+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣)方案新輔助化療4個療程后，直腸癌組織PD-1/PD-L1的表達均較化療前增強。Hecht等[25]也研究了放化療對直腸癌PD-L1表達的影響，結果發現，放化療可增加癌細胞PD-L1的表達率。Jomrich等[26]研究發現，大約17%的直腸癌組織在放化療后出現淋巴細胞PD-L1表達增強，但直腸癌細胞PD-L1的表達變化不明顯。以上研究提示，放化療可能改變腫瘤免疫微環境，放化療結合抗PD-L1治療可能是進展期直腸癌更有效的治療方案。

5.3抗PD-1/PD-L1的療效 當前對CRC的抗PD-1/PD-L1治療已取得進展。Capasso等[27]在人源化小鼠模型上研究抗PD-1治療對人結腸癌細胞移植的影響發現，抗PD-1治療可增強T細胞的抗腫瘤反應，并抑制結腸癌細胞的增殖。在MSI-H-CRC動物模型中這種反應更顯著，且與腫瘤中更多的CD8+γ干擾素+T淋巴細胞相關[27]。

Ott等[28]研究發現，直腸肛管癌PD-L1的陽性表達率為74%(38/43)。采用PD-1抗體治療24例PD-L1陽性肛管鱗狀細胞癌患者，每2周給予10 mg/kg的Pembrolizumab，隨訪到治療結束后56周發現，4例(17%)緩解，10例(42%)穩定，疾病控制率為58%，16例(67%)有藥物相關不良反應，主要為腹瀉、惡心、乏力，并無藥物導致的死亡[28]，顯示了Pembrolizumab治療肛管癌的有效性和安全性。

Le等[8]采用Pembrolizumab治療11例dMMR/MSI-H-mCRC患者、21例pMMR/MSS-mCRC患者及9例dMMR的非CRC患者，方案為10 mg/kg，每2周1次。結果發現，dMMR/MSI-H-mCRC組患者的客觀有效率為40%(4/10)，20周時疾病無進展生存率為78%(7/9)；但pMMR/MSS-mCRC組客觀有效率為0%(0/18)，20周時疾病無進展生存率僅為11%(2/18)。深入分析發現，Lynch綜合征相關腫瘤(胚系突變)的客觀有效率為27%(3/11)，而非Lynch綜合征的dMMR腫瘤(包括CRC與其他腫瘤)的客觀有效率為100%(6/6)[8]。提示Pembrolizumab治療dMMR/MSI-H-CRC的有效率明顯優于pMMR/MSS-CRC，且在非Lynch綜合征的dMMR腫瘤(包括CRC與其他腫瘤)中可能療效更顯著。美國食品藥品管理局于2017年底批準抗PD-1藥物Pembrolizumab用于轉移性MSI-H-CRC的臨床治療，后來Le等[29]研究一線化療方案失敗的MSI-H-mCRC患者，方案是每3周給予Pembrolizumab 200 mg，結果總體客觀有效率為33%(21/63)，有2例甚至實現完全緩解，中位無進展生存期為4.1個月，1年無進展生存率達41%，1年總生存率達76%。另有學者使用Pembrolizumab聯合mFOLFOX6(奧沙利鉑+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣)化療方案治療30例不可切除的CRC(包括dMMR和pMMR病例)，結果15例實現完全緩解或部分緩解，1例dMMR病例實現病理緩解，14例保持穩定[30]。以上研究提示Pembrolizumab在CRC治療中的價值。

Overman等[31]采用Nivolumab(納武利尤單抗，一種PD-1抗體)治療74例dMMR/MSI-H轉移性CRC患者，方案為每2周給予3 mg/kg，隨訪至少12周發現，客觀有效率為31%(23/74)，疾病控制率為69%(51/74)，其中8例的治療有效時間持續了至少1年。用藥1年的無進展生存率為50%，總生存率為73%。2017年8月美國食品藥品管理局批準了Nivolumab用于dMMR/MSI-H轉移性CRC患者的治療。

Yanik等[32]研究了23例合并人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染的直腸肛管癌患者發現，免疫細胞PD-L1的表達與免疫細胞的浸潤密度和CD8+T細胞密度相關，但有無HIV感染卻與肛管癌組織PD-L1表達、免疫細胞浸潤程度以及構成無顯著相關性。因而對于HIV感染的肛管癌患者也可以嘗試抗PD-1/PD-L1免疫治療。

6 展 望

近年來腫瘤的免疫治療取得了重大進展，抗PD-1藥物如Pembrolizumab已正式用于黑色素瘤、肺癌、尿路上皮癌等腫瘤的治療。CRC的相關研究也正在積極進行中。當前觀點認為，抗PD-1治療的效果在dMMR/MSI-H-CRC中可能更好，美國食品藥品管理局也批準Pembrolizumab、Nivolumab等抗PD-1藥物用于轉移性MSI-H-CRC的治療。相信隨著臨床數據的積累，免疫治療可能成為CRC除手術、化療、放療、靶向治療之外的又一選擇。當然，CRC的免疫治療尚有很多疑問，如免疫治療的時機，免疫治療與手術、化療、放療、靶向治療的關系以及聯合運用方案，免疫治療的療效與毒副作用等，這些需要未來進一步探索研究。