干細胞移植治療肌萎縮側(cè)索硬化的研究進展

張文沫，豐宏林

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，哈爾濱 150001)

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種破壞性神經(jīng)退行性疾病，累積上、下運動神經(jīng)元，其特征為運動神經(jīng)元的喪失，可導(dǎo)致進行性肌肉無力和萎縮、呼吸衰竭和死亡，疾病進展通常較快，平均生存期為癥狀出現(xiàn)后2～3年，發(fā)病率達1/100 000～2/100 000[1]，目前其發(fā)病原因及發(fā)病機制尚不清楚，存在自身免疫、氧化應(yīng)激、興奮毒性、神經(jīng)炎癥等多種假說，許多環(huán)境因素(如吸煙、重金屬或殺蟲劑、輻射和某些類型的體育活動)也被認為可能與ALS的神經(jīng)病理學改變相關(guān)[2]。ALS主要分為散發(fā)性ALS(sporadic amyotrophic lateral sclerosis，sALS)和家族性ALS(familial amyotrophic lateral sclerosis，fALS)兩種類型。10%～15%的fALS與人類染色體30多個區(qū)域的大量基因突變有關(guān)，其余85%～90%的fALS病因不明[3]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)[4]、TARDBP[5]、FUS[6]、OPTN[7]、VCP[8]、UBQLN2[9]、C9orf72[10]和TBK1[11]等20多種基因與ALS相關(guān)，且遺傳和非遺傳因素均在ALS發(fā)病中起作用。

為了尋找ALS的治療藥物以及延緩疾病進展，學者開展了許多針對ALS的動物模型實驗和臨床前人體試驗，但迄今為止還沒有真正的突破。美國食品藥品管理局批準利魯唑(阻止過量神經(jīng)傳遞的神經(jīng)保護藥物)和依達拉奉(抗氧化劑)用于ALS的治療[12]。利魯唑是首個獲批用于ALS治療的藥物，與安慰劑相比，利魯唑治療ALS患者的預(yù)后顯著改善[13]。依達拉奉是一種自由基清除劑，被批準用于腦栓塞的治療。依達拉奉的第三階段臨床試驗(MCI186-19研究)證實，其能夠抑制ALS患者運動無力的惡化，并能顯著改善ALS功能評分量表評分。有數(shù)據(jù)顯示，ALS患者早期開始依達拉奉治療的效果更好[13]。

以干細胞為基礎(chǔ)的治療是目前神經(jīng)退行性疾病治療的研究熱點。細胞治療通過移植新的神經(jīng)元替換退化或死亡的神經(jīng)元，使干細胞或祖細胞以某種方式在體內(nèi)分化為所需的細胞類型。現(xiàn)就干細胞移植治療ALS的研究進展予以綜述。

1 間充質(zhì)干細胞

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于中胚層的多能干細胞，可來源于新生兒和成人的多種組織，如臍帶血[14]、臍帶組織[15]、骨髓[16]、脂肪組織[17]和口腔組織[18]。MSCs移植作為多種組織和器官疾病的治療方案，在動物模型實驗和人體試驗中得到了證實，包括缺血性腦損傷[19]和神經(jīng)退行性疾病[20]。目前，鞘內(nèi)注射和靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的Ⅰ期試驗尚無相關(guān)不良反應(yīng)的報道[21]；此外，注射脂肪來源MSCs的相關(guān)試驗也較安全[22]。已有研究表明，將人或嚙齒動物來源MSCs移植至標準SOD1突變體SOD1G93A小鼠，能明顯改善運動功能和延長壽命，與0.9%氯化鈉注射液組相比，MSCs組小鼠四肢的運動活性和運動功能更好，體重下降速度減慢，平均壽命延長[23]。對ALS患者進行早期觀察和0期自體MSCs移植實驗的研究表明，椎管內(nèi)注射自體MSCs的耐受性良好，且未出現(xiàn)不可逆的手術(shù)相關(guān)不良反應(yīng)[24-26]，隨后的Ⅰ期試驗和長期隨訪均證明了其安全性[27-28]。

近年來，越來越多的研究對大量受試者進行了更詳細的試驗。有文獻報道，與標準對癥治療(如神經(jīng)代謝藥物)對照者相比，接受MSCs移植ALS患者的疾病進展緩慢，尤其是假性延髓麻痹和呼吸系統(tǒng)疾病，可見MSCs移植能夠提高ALS患者的生活質(zhì)量[29]。有學者將37例BMSCs移植ALS患者分為“應(yīng)答者”和“無應(yīng)答者”兩組，結(jié)果顯示前者ALS功能評分量表評分的降幅明顯較小[30]。另有研究使用培養(yǎng)中分化的BMSCs增強神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，將這些細胞肌內(nèi)聯(lián)合鞘內(nèi)注射給14例患者，與移植前3個月的磨合期相比，BMSCs移植后6個月的隨訪期內(nèi)ALS功能評分量表評分和用力肺活量下降程度均減少[31]。由此可見，BMSCs移植可改善ALS患者的臨床癥狀。

研究表明，MSCs在培養(yǎng)中的神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化是可以實現(xiàn)的[32]。將BMSCs或表達神經(jīng)營養(yǎng)素受體細胞移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中時，其可表達神經(jīng)元或膠質(zhì)標志物[33]。有報告顯示，移植的MSCs可表達多個運動神經(jīng)元標志物，表明MSCs可分化為運動神經(jīng)元樣細胞[34]。MSCs移植治療可能通過延長受損運動神經(jīng)元的生存時間以及保存現(xiàn)有運動回路來發(fā)揮作用，可以通過以下幾種方式實現(xiàn)。

1.1MSCs分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的旁分泌效應(yīng) 表達腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)生長因子的人MSCs均能促進運動神經(jīng)元的存活[35]。人臍帶MSCs能夠分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子3、血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子-1、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)生長因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)6種不同的神經(jīng)營養(yǎng)因子，這些分泌因子單獨或聯(lián)合均可以旁分泌的方式促進病變運動神經(jīng)元的存活[36]。

1.2MSCs對外周血T細胞的免疫調(diào)節(jié)作用 幾乎所有的神經(jīng)退行性疾病均伴有一定程度的炎癥反應(yīng)，ALS的發(fā)生和發(fā)展與循環(huán)免疫細胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中免疫細胞誘發(fā)的神經(jīng)炎癥有關(guān)[37]。炎癥抑制調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)水平與ALS疾病進展和嚴重程度相關(guān)是循環(huán)免疫細胞影響ALS發(fā)病及進展的重要發(fā)現(xiàn)之一[38]。在病情進展迅速的ALS患者中，Treg細胞數(shù)量以及Treg細胞表達的重要標志物叉頭樣螺旋轉(zhuǎn)錄因子3的水平均降低，且Treg細胞數(shù)量與疾病進展速度呈負相關(guān)[39]。MSCs與ALS患者外周血單核細胞共培養(yǎng)時，γ干擾素、白細胞介素-4、白細胞介素-10等抗炎細胞因子水平升高，Treg細胞誘導(dǎo)增強[40]；此外，MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力明顯由固有免疫介導(dǎo)的Toll樣受體介導(dǎo)[41]。因此，隨著外周免疫細胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤，MSCs移植誘導(dǎo)的Treg細胞潛能顯得尤為重要。

1.3MSCs對膠質(zhì)細胞介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的潛在調(diào)節(jié)作用 除外周免疫細胞外，MSCs還可以調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細胞的固有免疫反應(yīng)。非神經(jīng)元細胞自主性因素是ALS的重要病理學特點，而中樞神經(jīng)膠質(zhì)細胞對運動神經(jīng)元的死亡起著至關(guān)重要的作用。小膠質(zhì)細胞相當于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的外周免疫細胞，幾乎與所有的神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[42]。活化的小膠質(zhì)細胞在神經(jīng)元保護和損傷中起重要作用。MSCs對小膠質(zhì)細胞活化具有調(diào)節(jié)作用。在小鼠小膠質(zhì)細胞系的實驗?zāi)Ｐ椭校琈SCs通過可溶性因子(如轉(zhuǎn)化生長因子-β)減少脂多糖刺激下的小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)和增殖[43]，且在動物ALS模型中移植人MSCs可以調(diào)節(jié)疾病環(huán)境中的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[44]，但其影響機制尚待深入研究。

在以細胞為基礎(chǔ)的移植治療中，移植細胞的存活和復(fù)制至關(guān)重要，且中樞神經(jīng)系統(tǒng)環(huán)境的惡化不利于移植MSCs的存活。此外，人類受體中的移植MSCs的進一步追蹤和長期復(fù)制潛能(包括腫瘤發(fā)生潛能)的監(jiān)測尚未實施。非侵入性技術(shù)的發(fā)展，如基于近紅外線的發(fā)光探針標記移植細胞成像[45]，可能更好地實現(xiàn)對MSCs的追蹤。未來MSCs的相關(guān)發(fā)展對于ALS甚至任何基于干細胞的治療平臺均至關(guān)重要。

2 誘導(dǎo)多能干細胞

誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)也是一種自體細胞來源的誘導(dǎo)型多能干細胞，可分化成多種細胞類型，如特異性運動神經(jīng)元細胞，在ALS等退行性疾病的治療方面具有巨大的應(yīng)用前景[46]。Sareen等[47]利用人類成纖維細胞系進行的臨床前研究證明，iPSCs衍生細胞可以移植并整合到大鼠脊髓中。另有文獻報道，iPSCs人類白細胞抗原特征的iPSCs數(shù)據(jù)庫可能代表了一種很有前景的技術(shù)，可獲得高質(zhì)量細胞產(chǎn)物，并可降低移植物排斥反應(yīng)的風險，且人iPSCs在ALS嚙齒動物衍生神經(jīng)干/祖細胞移植的應(yīng)用中顯示出一定程度的療效[48]。此外，將iPSCs分化為類似中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，即腦器官，不僅為人類大腦發(fā)育和疾病再現(xiàn)的研究提供了機會，還為細胞移植提供了新的來源。現(xiàn)已成功嘗試將人腦器官移植至嚙齒動物腦內(nèi)，植入后的微型大腦整合到宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，表現(xiàn)出進行性神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)分化，在宿主腦的多個區(qū)域形成血管網(wǎng)絡(luò)，且軸突連接不斷增長[49]。目前，首例帕金森病患者移植iPSCs衍生多巴胺能神經(jīng)元的試驗已完成，且越來越多的iPSCs衍生細胞療法正在進行臨床試驗測試[50]。首次基于iPSCs移植的ALS臨床試驗已于2019年開始[51]。

iPSCs為神經(jīng)退行性疾病的細胞病因?qū)W提供了新的線索。iPSCs不僅具有自我更新、產(chǎn)量高、可擴增等優(yōu)點，還具有產(chǎn)生多種不同神經(jīng)元亞型的潛力[52]。iPSCs在疾病神經(jīng)元衍生中具有明顯作用，特別是可保留與年齡相關(guān)的疾病特征，這是神經(jīng)退行性疾病模型建立的關(guān)鍵，但iPSCs仍有其局限性，其潛在機制仍有待證實。

3 神經(jīng)干細胞

MSCs和免疫細胞可能通過旁路效應(yīng)對ALS產(chǎn)生積極影響，但不能取代受損中樞神經(jīng)細胞。神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)指神經(jīng)系統(tǒng)中具有分化潛能的神經(jīng)細胞(如神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞)，可為腦組織提供大量的細胞群。神經(jīng)干細胞可能提供神經(jīng)營養(yǎng)支持和取代膠質(zhì)細胞或中間神經(jīng)元，并可能通過分泌多種分子和生長因子發(fā)揮神經(jīng)保護作用。歐洲和美國已經(jīng)開展了利用人胚胎組織來源的神經(jīng)干細胞在培養(yǎng)物中擴增的ALS相關(guān)試驗[53-54]。有研究使用從人類8周胚胎脊髓中獲得的特殊的人脊髓源性干細胞系(human spinal cord-derived stem cells，HSSCs)，將該細胞系置于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并使用維持細胞增殖和避免細胞分化的成纖維細胞生長因子-2進行體外擴增[55]。臨床前研究表明，HSSCs主要產(chǎn)生中間神經(jīng)元，少數(shù)分化為星形膠質(zhì)細胞[56]。此外，HSSCs能夠分泌生長因子(包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和GDNF)，植入后，這些細胞可以表達谷氨酸轉(zhuǎn)運體，可恢復(fù)受損運動神經(jīng)元周圍的功能性興奮性氨基酸再攝取[57]。對ALS大鼠模型中HSSCs移植的研究顯示，與接受死細胞移植對照組相比，HSSCs移植組的ALS發(fā)病時間延遲，存活時間延長，腹角運動神經(jīng)元增加，對運動癥狀的積極影響短暫，但通過多次脊髓NSCs注射可以有效改善ALS動物模型的存活率[58]。

將胎兒皮質(zhì)來源的NSCs移植至ALS模型SOD1G93A大鼠脊髓后，NSCs能夠分化為神經(jīng)保護性星形膠質(zhì)細胞；若NSCs經(jīng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生GDNF，對ALS模型SOD1G93A大鼠的運動神經(jīng)元產(chǎn)生有益影響，不僅可延緩ALS模型SOD1G93A大鼠的發(fā)病、延長其存活時間、改善上運動神經(jīng)元的健康狀況，甚至可提高ALS模型SOD1G93A大鼠脊髓運動神經(jīng)元的存活率[59]。ALS患者的萎縮脊髓可以耐受至少3 mL 細胞懸液以及最多20次不同脊髓節(jié)段的注射；且NSCs移植后隨訪2年，未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長[60]。可見，NSCs移植未加速ALS的疾病進展，且ALS患者的NSCs移植相對安全可行。

目前基于臨床前試驗的NSCs研究極有限，小范圍治療試驗的療效評估很難，尤其是無隨機安慰劑或觀察對照組的試驗。ALS的臨床進展高度可變，目前導(dǎo)致這種變異的生物因素仍未知。因此，應(yīng)謹慎應(yīng)對個體間疾病病程差異的因果關(guān)系。現(xiàn)有NSCs移植治療ALS的相關(guān)實驗證據(jù)的療效是否能夠立即進行臨床治療試驗仍有待商榷，在進一步的臨床試驗前，是否有必要提高NSCs移植的療效亦有待研究。

4 胚胎干細胞

人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)是一種源于人囊胚內(nèi)細胞團，經(jīng)體外分離、培養(yǎng)獲得的原始多能干細胞[61]。Wyatt等[62]將hESCs衍生的人運動神經(jīng)元祖細胞移植到ALS動物模型發(fā)現(xiàn)，移植后的人運動神經(jīng)元祖細胞可使大量的內(nèi)源性神經(jīng)元存活，并產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)作用。Izrael等[63]利用hESCs作為大量星形膠質(zhì)細胞祖細胞的來源，進一步將星形膠質(zhì)細胞祖細胞擴增并分化為可表達90%以上膠質(zhì)纖維酸性蛋白的人類胚胎干細胞星形膠質(zhì)細胞(human embryonic stem-astrocytes，hES-AS)，且移植后hESCs來源星形膠質(zhì)細胞的功能特性已得到體外實驗的證明。Izrael等[63]進一步對ALS動物模型(高拷貝數(shù)hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠和大鼠)的研究發(fā)現(xiàn)，hES-AS鞘內(nèi)注射可明顯延緩hSOD1G93A小鼠和大鼠ALS的發(fā)病，并有助于維持運動功能和延緩死亡；與正常星形膠質(zhì)細胞相似，hESCs可通過多種機制保護運動神經(jīng)元，如清除谷氨酸、分泌多種神經(jīng)保護因子、中和活性氧類、促進神經(jīng)生長；與空白載體溶液對照組相比，hESCs治療組大鼠運動能力維持正常時間延長1個月以上；hESCs治療組大鼠的中位生存期為216 d，而對照組大鼠的中位生存期為182 d，表明鞘內(nèi)注射可延緩ALS發(fā)病和疾病進展，進而延長生存期。對免疫功能低下動物模型進行為期9個月的安全性研究顯示，鞘內(nèi)移植hES-AS是安全的[63]。上述研究均證實了鞘內(nèi)注射hESCs治療ALS的可行性、安全性和潛在療效，但治療ALS的臨床試驗仍然很少，hESCs相關(guān)研究所涉及的倫理問題還有待解決，且安全性也有待進一步探究；此外，hESCs的來源有限，且體外分化的條件極高，這些均限制了hESCs的應(yīng)用和發(fā)展。

5 小 結(jié)

干細胞的臨床前研究為人類試驗奠定了基礎(chǔ)，將干細胞分化為具有治療潛力的細胞，揭示了通過改善疾病微環(huán)境毒性減緩神經(jīng)退行性變的可能機制。目前，干細胞移植仍處于發(fā)展階段，早期臨床試驗已證實了其安全性，干細胞的再生能力較強，但現(xiàn)有技術(shù)尚無法將其充分利用并用于治療神經(jīng)退行性疾病。迄今為止，干細胞移植研究成果是否足以支持進一步的臨床治療試驗仍有待深入研究，在已經(jīng)證明安全的干細胞源中，確定最有效的干細胞來源、劑量、給藥部位及方法，對進一步提高干細胞移植治療的功效具有重要意義。干細胞移植在治療ALS和其他神經(jīng)退行性疾病方面具有巨大的應(yīng)用潛力，但以干細胞為基礎(chǔ)的治療仍需要大量研究。