糖尿病腎臟病與足細胞自噬

馮祥田，于為民

(1.山西醫科大學，太原 030000； 2.山西白求恩醫院腎內科，太原 030000)

糖尿病是危害人類健康的疾病之一，患病群體龐大。糖尿病及其并發癥給患者帶來巨大痛苦，并嚴重影響生活質量。據《國際糖尿病聯盟全球糖尿病地圖(第9版)》最新數據顯示，全球20～79歲人群中約有4.6億(占比9.3%)患糖尿病，2019年因糖尿病及其并發癥死亡的人數約為420萬[1]。糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病最嚴重的微血管并發癥之一，也是終末期腎病的主要原因。DKD的一個重要臨床特征是蛋白尿。糖尿病蛋白尿患者腎小球濾過屏障結構發生改變，包括腎小球內皮細胞損傷、足細胞丟失、腎小球基膜增厚和系膜擴張。除基底膜功能障礙外，晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)的積累、氧化應激以及內質網應激的激活也是導致腎功能下降的原因[2-5]。自噬尤其是足細胞自噬與DKD關系密切，足細胞自噬異常可能在DKD的發生發展過程中發揮重要作用。現就DKD與足細胞自噬的關系及其涉及的具體機制進行綜述。

1 DKD與足細胞損傷自噬

“自噬”一詞可追溯至古希臘，意為“自我吞噬”。現代生物學中“自噬”代表一種在各種細胞中普遍存在的細胞過程，主要指在某些生理或應激條件下，細胞內錯誤折疊的蛋白質或其他受損的細胞器以囊泡的形式運送到溶酶體，通過溶酶體降解和循環，以維持細胞內的穩態。根據發生機制、功能的不同，自噬可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬，通常所說的“自噬”為巨自噬。根據降解底物的不同，自噬也可分為選擇性自噬和非選擇性自噬。選擇性自噬涉及一些受損細胞器的降解、脂噬或異種吞噬，而缺乏營養誘導的自噬被認為是非選擇性自噬[6]。自噬主要是由自噬相關基因(autophagy associated gene,ATG)產物協同作用導致的復雜過程，目前已經發現的自噬相關蛋白(Atg)有近40種，根據參與的過程，可分為4類：①unc-51樣自噬激活激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)-Atg13-FIP200(FAK-family interacting protein of 200 kDa)復合體，ULK1、Atg13和FIP200形成的復合體可以定位自噬的隔離膜，并調節自噬體生物合成；②Vps34復合體由hVps34、hVps15、Beclin-1以及Atg14組成，主要參與形成自噬體；③Atg5-Atg12-Atg16和Atg8/自噬相關基因微管相關蛋白1輕鏈3兩個泛素連接系統。Atg在酵母菌和哺乳動物中高度保守，并在自噬體的形成過程中參與膜轉運過程[7]。

足細胞自噬對腎臟功能的完整性至關重要[8]。足細胞是一種存在于腎小球基膜表面的高度分化的細胞，其在腎小球基膜上形成許多突起，被稱之為“足突”，足突交叉相接形成裂孔結構，裂孔上覆有一層4～6 nm厚的裂孔膜[9]。足細胞和足突間的裂孔膜是腎小球濾過屏障中最重要的成分，足細胞損傷是急性腎損傷的典型特征，可導致蛋白尿和營養丟失[8,10-11]。對小鼠的研究發現，正常腎組織中足細胞表現出較高水平的自噬，形成豐富的自噬小體[12]。Vps34復合體缺失的9周齡小鼠表現出早期蛋白尿、進行性腎小球硬化和腎衰竭等癥狀[12]。足細胞ATG5基因缺失可導致衰老小鼠的腎小球病變，而氧化和泛素化相關蛋白的積累和足細胞內質網應激最終可導致足細胞丟失、蛋白尿增加以及腎小球硬化等[11,13]。

Lenoir等[14]研究發現，高糖環境激活了足細胞自噬，保護足細胞免受高血糖相關的凋亡。在糖尿病小鼠中，ATG5基因敲除使自噬激活缺乏，進而導致更嚴重的蛋白尿和腎功能受損[5,15]。在DKD中，腎臟自噬受損也會導致足細胞丟失和大量蛋白尿[16]。糖尿病小鼠雷帕霉素靶蛋白復合體1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)活性降低可刺激自噬，減少腎小球硬化、蛋白尿和足細胞丟失，從而減緩DKD進展[3]。但有研究表明，高糖通過激活胱天蛋白酶3，導致足細胞凋亡[17]。在高糖刺激下，人足細胞自噬相關基因微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ和Beclin-1顯著減少，自噬活性降低[18]。目前這些爭議尚未解決，還需要進一步研究。以上研究均表明，足細胞自噬在DKD中有重要作用，而自噬也可能成為DKD治療的重要靶點。

2 營養傳感途徑與DKD足細胞損傷自噬

影響自噬的因素較多，參與自噬調控的通路也較多，如轉化生長因子-β1通路、Rho/Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶通路、Wnt/β聯蛋白通路、Notch通路等，其中營養傳感途徑在自噬調控中尤為重要。目前已知的營養傳感途徑主要包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)、去乙酰化酶(sirtuin，SIRT)3等。在過度營養的條件下，葡萄糖、氨基酸和胰島素等生長因子水平的升高會激活mTOR[19-20]；在營養/能量耗竭的條件下，細胞內AMP和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotid，NAD+)水平的升高會激活AMPK和SIRT信號途徑[21-22]。這些營養傳感途徑的失調可能會損害自噬活性，導致DKD患者腎臟損傷加重[23-24]。

2.1mTOR途徑 mTOR是磷脂酰肌醇-3-激酶家族的成員，是細胞代謝的關鍵參與者之一，在維持營養有效性、能量以及機體平衡中有重要作用[25]。mTOR被認為是DKD中最重要的自噬調節因子之一。mTOR可與相關蛋白結合形成兩種不同的復合體，即mTORC1和2。mTORC1對雷帕霉素敏感，由mTOR、G蛋白β亞基樣蛋白、mTOR調節相關蛋白、40 kD大小的富含脯氨酸蛋白激酶B底物蛋白和含DEP結構域的mTOR相互作用蛋白組成[26]。對雷帕霉素不敏感的mTORC2由mTOR、雷帕霉素不敏感的mTOR伴侶、G蛋白β亞基樣蛋白、在雷帕霉素不敏感的mTOR伴侶中觀察到的蛋白質以及應激激活的蛋白激酶相互作用蛋白1組成[26]。

mTORC1主要通過小GTPase接受營養輸入，參與功能的小GTPase主要有Ras相關的GTP結合蛋白和腦中富集的Ras同源蛋白(Ras homolog enriched in brain，RHEB)。氨基酸和生長因子水平的升高分別通過Ras相關的GTP結合蛋白和RHEB激活mTORC1，mTORC1的激活促進兩個下游靶標分子的磷酸化，刺激核糖體生物發生和蛋白質合成。結節性硬化復合物(tuberous sclerosis complex,TSC)1/2是mTOR基因上游抑制因子，抑制RHEB負向調節mTORC1的活性[26]。過度激活的mTOR是引起腎小球損傷的重要因素之一，如敲除TSC1可發現mTORC1過度活化、足細胞和腎小球受損[27]。具體而言，mTOR1通過磷酸化ULK1而抑制其活性，負調節自噬[28]。然而在營養缺乏或其他應激信號的細胞中，mTORC1的表達被抑制，AMPK途徑激活ULK1，促進自噬發生[29]。雷帕霉素可抑制mTORC1信號通路，保護腎臟。低劑量的雷帕霉素可通過調節糖尿病小鼠的自噬而改善足細胞損傷，維持足細胞數量的穩定[29]。

mTORC1對于維持足細胞的功能至關重要，并參與DKD的發生發展。目前對于mTORC2在足細胞自噬中的調節作用仍不明確，需要進行深入研究。

2.2AMPK途徑 AMPK是一種進化上保守的異源三聚體蛋白復合物，由α、β、γ三個亞單位組成，在細胞能量穩態和代謝中起關鍵作用。AMPK的激活是由幾種上游激酶介導的，在能量應激條件下，肝激酶B1是磷酸化AMPK的主要激酶[30]。與mTORC1相比，AMPK是對營養/能量消耗響應的自噬的正性調節劑。一方面，AMPK可以直接磷酸化ULK1以促進自噬(與mTORC1磷酸化ULK1的位點不同)[31]；另一方面，AMPK可通過磷酸化TSC1/2和mTOR調節相關蛋白抑制mTORC1的活性，進而發揮自噬誘導作用[32]。除了AMPK和mTORC1對ULK1的相反調節外，ULK1還可通過負反饋抑制兩個上游調節子。這三種相互聯系的蛋白質的復雜串擾和反饋可能會進一步調節代謝應激條件下的自噬反應。

在1型和2型糖尿病模型的腎臟中，AMPK的活性被抑制，多種AMPK激活劑可以減輕糖尿病性腎損傷。AMPK抑制劑白藜蘆醇可促進AMPK的磷酸化，有效減輕糖尿病小鼠細胞外基質擴張、炎癥和蛋白尿[33]。二甲雙胍是一種AMPK刺激劑和抗糖尿病藥，其可保護足細胞免受糖尿病的傷害[33]。一項研究表明，小檗堿對2型糖尿病小鼠的腎保護作用是AMPK依賴性的[34]。在培養的小鼠足細胞中，小檗堿通過重新激活AMPK和自噬抑制高糖誘導的細胞凋亡[35]。

除自噬調節外，AMPK還介導腎臟的一系列代謝過程，如脂質代謝、糖原合成以及腎小管對Na+和葡萄糖的重吸收。糖尿病條件下腎臟AMPK活性的降低可能損害以上代謝過程以及自噬抑制，導致DKD的腎小管和腎小球病變[23]。

2.3SIRT1途徑 SIRT是NAD+依賴的Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶(NAD+-dependent class Ⅲ histone deacetylases，HDAC)，在細胞應對氧化還原和代謝壓力過程中發揮重要作用[36]。目前已鑒定出7個哺乳動物的SIRT(SIRT1～SIRT7)，其中SIRT1研究得最多。SIRT1通過監測NAD+水平發揮細胞內營養感受器的作用，進而調節代謝和氧化還原狀態。在營養缺乏和氧化應激條件下，細胞內NAD+水平升高會上調SIRT1，而缺氧時NAD+可用性降低，可能會使SIRT1失活[36]。SIRT1是自噬的正調控因子，一旦激活可通過去乙酰化必需的自噬蛋白(如ATG5、ATG7和自噬相關基因微管相關蛋白1輕鏈3)促進自噬[37]。

SIRT1主要在腎內髓和腎間質表達，可能具有保護腎臟免受氧化應激的作用。與AMPK相似，在人和動物的DKD模型中，SIRT1的表達和活性均有降低的趨勢，SIRT1的激活可以保護腎臟免受糖尿病的損傷[38]。糖尿病小鼠腎小球SIRT1表達減少可導致AGEs積聚和轉錄因子叉頭框蛋白O4乙酰化，白藜蘆醇可保護足細胞免受AGEs誘導的凋亡[39]。發生蛋白尿前，在糖尿病小鼠的足細胞和近端小管中檢測到SIRT1的抑制；而近端小管特異表達SIRT1的小鼠對糖尿病相關的足細胞損傷進展和隨后的蛋白尿具有抵抗力[39]。研究發現，白藜蘆醇對2型糖尿病大鼠和缺氧處理的人來源腎近端小管上皮細胞的保護作用依賴于其對SIRT1的重新激活和隨后的自噬恢復[40]。以上研究表明，SIRT1對腎臟有保護作用，SIRT1活性降低通過抑制自噬而導致與DKD相關的腎臟損傷。

除SIRT外，HDAC家族其他分子也與腎臟損傷有關，這些分子可能成為潛在的治療靶點。目前在哺乳動物細胞中鑒定的HDAC基因有18個，根據序列同一性和結構域的不同可分為Ⅰ～Ⅳ類，其中Ⅲ類HDAC(SIRT)是NAD+依賴的，其他(Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類)HDAC主要依賴于Zn2+。與SIRT對腎臟的保護作用不同，Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類HDAC的表觀遺傳學修飾在DKD的發生發展中有重要作用。這表明不同的HDAC在DKD中可能有不同的功能，除SIRT的保護作用外，其他HDAC可能也參與了腎臟的損傷過程。為確定單個HDAC的作用，Wang等[41]使用不同的DKD模型分析了HDAC的表達模式，在所有檢測的HDAC中，HDAC2、HDAC4和HDAC5在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠、2型糖尿病小鼠的腎臟以及糖尿病患者的腎組織中表達上調。不同類型的HDAC存在于不同類型的腎細胞中，HDAC2在腎近端小管上皮細胞中，HDAC4在足細胞中，HDAC5在系膜細胞中。高糖、AGEs和轉化生長因子-β處理的足細胞，HDAC4的表達也增加，提示HDAC4可能在糖尿病腎病足細胞的功能調節中起中心作用[41]。事實上，足細胞中選擇性上調HDAC4通過去乙酰化信號轉導及轉錄激活因子抑制自噬，并導致足細胞損傷。抑制HDAC4可防止足細胞自噬缺陷，從而保護足細胞免受DKD誘導的腎小球病變[41]。

總之，以上研究進一步證實了缺陷自噬與DKD進展之間的聯系，考慮到糖尿病腎臟中Ⅲ類SIRT和Ⅱ類HDAC4對自噬的相反作用，靶向HDAC治療DKD需要確定HDAC亞型特異性。

3 細胞內應激與DKD足細胞損傷自噬

除了營養傳感途徑外，自噬還受幾種細胞內應激信號的調控，如AGEs積累、氧化應激以及內質網應激。糖尿病條件下，mTORC1的過度激活或AMPK和SIRT1的失活抑制了腎臟中的自噬。自噬是一種代償反應，是由這些應激信號誘導的，目的是維持細胞的完整性。當這種適應性代償反應無效時，自噬所形成的受損細胞器(如線粒體和內質網)可能會在細胞中積累，并加劇DKD。

3.1AGEs AGEs是高糖狀態下的蛋白質、脂質、氨基酸、核酸等生物大分子物質的游離氨基與還原的醛基或酮基發生非酶糖基化反應形成的一類復雜物質。研究發現，AGEs對腎臟的損傷方式包括直接毒性作用和間接毒性作用兩種。Kanwar等[42]研究發現，高血糖狀態所引起的腎臟損傷會造成細胞內代謝狀態的改變，AGEs在腎臟組織中逐漸累積，直接造成DKD的發生。AGEs的間接毒性作用是指AGEs與其受體結合后，進而通過多種跨膜信號轉導機制，造成細胞功能障礙；AGEs與其受體結合后還可誘導細胞氧化應激，產生活性氧類(reactive oxygen species,ROS)、活化蛋白酶C等，導致氧化損傷，促進DKD的發生發展。Peng等[43]發現，糖尿病的血管并發癥可被AGEs的自噬清除作用緩解，而小鼠肝細胞生長因子重組體可加強內吞作用和AGEs的自噬清除作用，進而改善腎功能。

因此，靶向清除AGEs，降低AGEs水平可能對腎臟有保護作用，減緩DKD的發生發展。

3.2氧化應激 ROS通常由線粒體呼吸和各種代謝途徑中的氧化還原反應生成。過量的ROS通常是造成細胞損傷的原因，同時細胞內也有一組完備的抗氧化酶，ROS生成與抗氧化劑防御之間的不平衡導致了氧化應激[44]。糖尿病情況下，高血糖會增強腎臟中ROS的產生。高糖介導的細胞內代謝改變，包括葡萄糖的自氧化、晚期糖基化、蛋白激酶C活化和多元醇途徑流量的增加，這些是糖尿病腎中ROS的來源。糖尿病條件下，高水平的非酯化脂肪酸也可刺激ROS的產生[45]。

有研究表明，急性暴露于高葡萄糖可通過ROS激活自噬[15]。在暴露于高糖的永生化小鼠足細胞中，自噬在ROS產生的24 h內被誘導，而這一自噬可被抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸抑制[15]。足細胞暴露于血管緊張素Ⅱ中也可增強ROS的產生并誘導自噬，抗氧化劑治療可抑制自噬。以上研究表明，在早期糖尿病中，足細胞主動響應ROS發生自噬。氧化應激可以誘導自噬以移除受損的線粒體，進而降低ROS水平，保護腎臟功能。

3.3內質網應激 內質網是真核細胞中蛋白質合成、折疊和成熟所必需的細胞器。內質網穩態破壞導致未折疊和錯誤折疊的蛋白質累積，導致內質網應激并觸發未折疊的蛋白質反應。內質網應激可誘導自噬，并參與糖尿病及DKD的發生發展[46]。在DKD中，高血糖和高水平的非酯化脂肪酸誘導足細胞內質網應激、凋亡以及隨后的蛋白尿。有研究發現，從腎小球濾出的蛋白尿進一步加重了近端小管的內質網應激反應，導致腎小管間質損傷[47]。暴露于高糖和白蛋白的腎小管細胞，內質網應激也被誘導，并伴隨腎小管細胞凋亡。此外，老年糖尿病小鼠模型也存在內質網應激，激活CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白，加重糖尿病腎損傷；而CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白缺陷小鼠可降低DKD的發生率，進一步表明糖尿病誘導的內質網應激在腎臟損傷的發展中起重要作用[48]。

自噬在維持內質網結構和功能完整性方面也發揮著重要作用。糖尿病的自噬缺陷可導致內質網應激的延長和腎臟損傷，激活自噬、促進內質網降解的治療策略可以保護腎臟免受細胞毒性內質網應激。化學伴侶可以減輕內質網應激，抑制DKD損傷。研究發現，化學伴侶牛磺酸熊去氧膽酸能減少內質網應激、抑制AGEs誘導的凋亡[49]。采用化學伴侶牛磺酸熊去氧膽酸治療的糖尿病小鼠，自噬功能得以恢復，并伴隨足細胞損傷和蛋白尿的減少，初步證實了化學伴侶牛磺酸熊去氧膽酸對糖尿病小鼠腎臟的保護作用[49]。化學伴侶4-苯丁酸也表現出類似的作用[50]。以上研究結果進一步證實了內質網應激參與DKD的發病機制。化學伴侶通過重新激活自噬、抑制內質網應激，達到保護腎臟功能的目的。

4 小 結

DKD是糖尿病嚴重的微血管并發癥之一，研究DKD發生發展的機制對于DKD的防治具有重要意義。在高糖環境下，足細胞自噬可以保護足細胞免受高糖誘導的凋亡，從而保護腎臟功能，自噬的缺失會嚴重損傷腎臟的功能。足細胞自噬與DKD的發生發展密切相關，營養傳感途徑與足細胞自噬密切相關，mTOR途徑抑制足細胞自噬，參與DKD的發生發展；而AMPK途徑和Sirt1途徑促進足細胞自噬，激活AMPK途徑或Sirt1途徑可能有助于DKD的治療。

細胞內應激也是影響DKD足細胞自噬的重要因素，AGEs的直接和間接毒性作用損傷腎臟功能，靶向清除或利用自噬清除AGEs有助于DKD的治療；糖尿病條件下ROS激活足細胞自噬，而自噬誘導受損線粒體的移除，降低ROS水平，進而保護腎臟功能。內質網應激可以誘導自噬，參與DKD過程，靶向內質網應激的化學伴侶可以抑制糖尿病腎臟損傷，保護腎臟功能，有望成為治療DKD的藥物。目前，關于DKD足細胞損傷自噬的研究較多，但不同途徑的研究還有待于進一步深入，針對這些途徑的藥物也有待于開發，以期為DKD的治療提供新的方案。