缺血再灌注急性腎損傷機制研究進展

李爽，包宇實

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院腎內科，哈爾濱 150001)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是由各種原因引起的短時間內腎功能快速降低而出現的臨床綜合征，表現為腎小球濾過率降低，肌酐、尿素氮潴留，水電解質和酸堿平衡紊亂。嚴重的AKI可導致多器官功能障礙綜合征。近年來，突發性腎臟損傷伴膿毒癥和多器官功能障礙綜合征的病例逐漸增加，全球每年約有200萬人死于AKI，存活患者中部分可能發展為不同程度的慢性腎臟病[1]。鑒于AKI的高發病率和高病死率，國際急救醫學界及腎臟病學界提出了AKI的概念，期望盡量在病程早期，甚至在腎臟出現損傷而腎小球濾過率尚處于正常階段就能將其識別，并早期實施干預，提高患者的生存率。改善全球腎臟病預后組織指南將AKI定義為：48 h內血清肌酐增高≥26.5 μmol/L；明確或經推斷在7 d內血清肌酐增至≥1.5倍基礎值；或持續6 h尿量<0.5 mL/(kg·h)[2]。目前，對于AKI尚無有效地減輕腎組織損傷和促進腎組織修復的治療措施。缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是臨床AKI的重要發病原因，現就缺血再灌注AKI發病機制的研究進展予以綜述。

1 缺血再灌注AKI

IRI是一種病理狀態，其特征是最初限制器官的血液供應，隨后恢復灌注并伴隨再氧化，加重組織損傷。IRI是臨床導致AKI的最主要原因，腎臟缺血階段為腎臟損害的始動環節，腎臟微血管改變，伴隨缺血導致線粒體代謝障礙，細胞壞死；腎臟再灌注階段活性氧類的產生、細胞內鈣超載等變化更進一步加重了腎損傷[3]。

1.1腎臟微循環損傷 腎臟微血管系統參與腎小球濾過、腎小管重吸收，微血管系統的功能障礙和結構變化誘導腎損傷[4]。AKI血流動力學方面的腎臟微血管改變被公認為在AKI的病理生理學中起關鍵作用，微循環受損導致局部一氧化氮、活性氧類和氧氣供需失衡，受損傷的內皮細胞激活并表達新的細胞表面標志物，促進白細胞和血小板的募集和黏附，內皮細胞損傷和炎癥反應加重，繼而血管通透性增加，間質水腫加重，血管內血流進一步減少；與此同時，氧化應激和血管收縮以及前列腺素等物質的釋放，會加重血流緩慢甚至導致局部血液不流動的現象，閉塞的微血管系統加劇了腎臟損傷。活體顯微鏡下觀察顯示，IRI大鼠皮質管周毛細血管中的血流變得遲緩，恢復灌注后，管周毛細血管密度降低，可見，IRI所致微血管損傷的主要后果是管周毛細血管減少，加劇了腎臟持續性進行性的缺氧和腎纖維化的發展[5]。腎臟微血管靶向治療研究證實，敲除基質金屬蛋白酶2特異性基因或用基質金屬蛋白酶抑制劑改善缺血性AKI動物模型的微血管通透性[6]，或通過血管內皮生長因子給藥促進微血管內皮細胞的修復和增殖，均可改善腎臟損傷[7]。

1.2氧自由基、鈣超載和內質網應激的作用 氧自由基是具有高生物活性的氧分子，缺血再灌注AKI伴隨大量氧自由基的產生，加重腎損傷。缺氧時，ATP被快速降解為ADP和AMP，AMP進一步代謝為腺嘌呤核苷酸和次黃嘌呤，再灌注后缺氧細胞重新獲氧，缺氧過程大量積累的次黃嘌呤以分子氧作為電子受體反應后產生大量氧自由基；另外，缺氧條件下，Na+-Ca2+交換機制被激活，Ca2+大量內流，同時伴隨ATP供給不足，Ca2+回收障礙，致細胞內鈣超載，造成膜磷脂水解，引起細胞的急慢性損傷和死亡；Ca2+濃度升高，進入線粒體的超氧化物歧化酶減少，從而使氧自由基的清除減少，鈣超載與氧自由基相互影響導致腎臟缺血再灌注損傷加重[3]。

內質網負責正確的合成、組裝、修飾機體內的蛋白質。IRI后，細胞內Ca2+水平和氧化還原平衡改變觸發內質網應激反應，從而促進蛋白質正確折疊，促進細胞功能的恢復[8]。內質網應激包括3條未折疊蛋白反應，在IRI模型小鼠腎臟中，葡萄糖調節蛋白78和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)的表達均增加，說明IRI通過介導CHOP基因的表達，激活內質網應激反應[9]。CHOP基因缺失可以抑制IRI炎癥反應，有效減輕腎損傷，而敲除CHOP基因可減少IRI小鼠腎小管上皮細胞凋亡[10]。因此，針對內質網應激未折疊蛋白反應可能是預防或治療AKI的新方向。

2 炎癥反應與缺血再灌注AKI

炎癥反應是IRI后導致腎臟損傷的重要原因，炎癥反應損傷血管內皮細胞和腎小管上皮細胞從而導致腎臟組織損傷，腎功能降低。IRI時炎癥細胞浸潤腎臟實質，并分泌相應的炎癥因子，導致腎血管內皮細胞表達黏附分子和血管通透性增加，腎小管上皮細胞上調Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)增加補體結合，導致腎實質細胞損傷，腎功能急劇降低[11-12]。

2.1腎血管內皮細胞損傷 腎血管內皮細胞損傷是IRI的早期事件之一。先天免疫反應和后天性炎癥級聯反應作為缺血性AKI的發病機制是由內皮細胞損傷、激活以及與白細胞黏附分子的相互作用引發。研究證實，IRI后細胞內黏附分子1表達增加，中性粒細胞通過內皮趨化因子和黏附分子被吸引到腎臟炎癥部位，同時黏附到內皮細胞，導致活性氧類、蛋白酶、彈性蛋白酶、髓過氧化物酶釋放，加重IRI后的腎臟損傷[13]。此外，急性IRI小鼠腎臟內皮細胞趨化因子表達上調，促進巨噬細胞在腎臟組織中聚集，其中M1巨噬細胞參與損傷相關分子模式和病原體相關分子模式的激活，同時釋放趨化因子、促炎癥細胞因子和誘導型一氧化氮合酶，形成細胞毒性過氧亞硝酸鹽，在AKI期間加重腎臟炎癥損傷[14]。內皮細胞在AKI炎癥反應早期通過促進白細胞的黏附趨化來增加腎臟損害。

2.2腎小管上皮細胞損傷 IRI后，近端腎小管上皮細胞基底外側膜上的補體調節蛋白表達增加，調節 C3在管狀上皮細胞的沉積；另外，IRI后腎小管上皮細胞產生促炎趨化因子、巨噬細胞炎癥因子-2和角質形成細胞衍生的趨化因子等，激活調節性T細胞的表達和分泌，趨化中性粒細胞和巨噬細胞，激活補體替代途徑[15]。此外，上皮細胞和管周毛細血管之間有大量的樹突狀細胞，樹突狀細胞可釋放促炎細胞因子/趨化因子，介導CD1d分子激活恒定的自然殺傷T細胞與脂多糖類的抗原起反應，并與自然殺傷T細胞相互作用，激活天然免疫系統[16]。此外，樹突狀細胞和自然殺傷T細胞可結合CD40/CD40L誘導產生白細胞介素-12的強烈前向信號，促進恒定的自然殺傷T細胞觸發信號轉導及轉錄激活因子4磷酸化以及連續的γ干擾素分泌，加重炎癥損傷[16]。TLRs可識別病原體相關分子模式參與炎癥反應。IRI后，TLR2和TLR4通過腎小管上皮細胞內源性配體表達的上調，加重腎臟炎癥損傷；而敲除小鼠TLR2/TLR4基因或TLR中心信號髓樣分化因子88基因對缺血再灌注AKI起到保護作用[17]。另外，TLR9被認為與缺血性AKI的腎小管上皮細胞損傷有關，IRI可誘導TLR9內源性配體血漿線粒體DNA釋放[18]，而近端腎小管細胞TLR9的缺失，可抑制核因子κB介導的促炎途徑和胱天蛋白酶(caspase)-3/8介導的凋亡途徑，緩解壞死、凋亡和炎癥，對腎小管上皮細胞起保護作用[19]。同樣，在缺血再灌注AKI模型中使用TLR9抑制劑羥氯喹，可抑制核因子κB信號轉導途徑和組織蛋白酶的活性，激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3，減輕缺血再灌注AKI[20]。這些研究突出了缺血再灌注AKI炎癥反應在腎血管內皮細胞和腎小管上皮細胞損傷中的重要作用。

3 凋亡、細胞周期停滯和細胞壞死與缺血再灌注AKI

腎小管上皮細胞損傷和死亡是AKI的關鍵病理特征[21]。IRI通過氧化應激和炎癥反應等復雜的病理生理改變，引起腎小管上皮細胞損傷，導致嚴重的細胞凋亡或壞死，加重腎臟損傷。

3.1凋亡、細胞周期停滯與缺血再灌注AKI 細胞凋亡是外來因素觸發細胞內預存的死亡程序而引發的細胞程序性死亡。缺血再灌注AKI動物模型和人類AKI腎臟活檢均顯示腎小管上皮細胞發生了凋亡變化[22]。IRI后，凋亡信號分子(腫瘤壞死因子-α、Bax、caspase等)在腎小管上皮細胞高表達，體內促凋亡蛋白Bax表達上調，而抗凋亡基因Bcl-2表達下調[23]。IRI期間凋亡途徑激活的機制包括外在機制和內在機制，外在機制是由腫瘤壞死因子-α和凋亡相關因子配體與相關凋亡誘導受體的結合觸發，繼而通過激活啟動子caspase-8和caspase-10啟動蛋白水解級聯反應[24]；內在機制是由于線粒體外膜損傷使細胞色素C釋放到細胞質中，形成多蛋白復合物(即凋亡小體)，啟動caspase-9介導的蛋白水解級聯反應[25]。有學者利用間充質干細胞的抗凋亡特性對缺血再灌注AKI模型小鼠進行治療，結果發現，抗凋亡基因Bcl-2的表達升高，促凋亡基因Bax的表達下降，缺血再灌注AKI顯著改善[26]。

在真核生物中，細胞周期由4個不同的階段(G1、S、G2和M)組成。在正常腎臟中，僅有1%的腎小管上皮細胞處于增生期，而其余細胞均處于休眠期(G0期)[27]。AKI時，G0期的腎小管上皮細胞結束休眠，開始進入細胞周期的循環中，正常腎小管上皮細胞的周期啟動有利于腎臟損傷的修復，損傷細胞的細胞周期停滯于G1期可以防止損傷細胞的DNA復制。細胞內的細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)可促進細胞周期的進行，而對這一過程調節的蛋白質主要有兩類：一類包括p21、p27和p57蛋白家族，主要與CDK2結合并抑制其功能，阻止細胞進入G1晚期或S期；另一類蛋白家族是CDK抑制因子4家族，主要與CDK4/6結合使細胞停滯于G1期[27]。研究發現，AKI時細胞內的p21水平顯著升高，同時伴有細胞周期停滯，與p21敲除的大鼠相比，IRI后的野生型大鼠腎臟p21上調，腎臟損傷更輕[28]。另外，組織金屬蛋白酶抑制物2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)和胰島素樣生長因子結合蛋白7(insulin-like growth factors binding protein 7，IGFBP7)水平在AKI腎小管上皮細胞中也升高，兩者可分別誘導p27和p21的表達增加，從而阻止細胞進入下一個周期，且TIMP-2和IGFBP7是腎小管上皮細胞參與調節細胞周期的關鍵環節[29]。心臟手術前的缺血預處理使腎小管上皮細胞TIMP-2和IGFBP7的表達均上調，因此術后AKI出現的風險顯著降低[30]。近年來，TIMP-2和IGFBP7已成為臨床早期診斷AKI和預測AKI預后非常重要的生物標志物。

3.2細胞壞死與缺血再灌注AKI 長期以來，細胞壞死被認為是被動的非能量依賴性的細胞死亡，通過細胞腫脹和細胞膜破壞釋放損傷相關模式分子，如高遷移率族蛋白、ATP等，隨后激活炎癥和免疫系統，加重組織損傷。腎小管上皮細胞壞死是缺血再灌注AKI的主要病理特征。近年研究表明，細胞壞死取決于細胞內Ca2+積累和蛋白酶活化的綜合結果[31]。組織缺血缺氧時ATP不足，損傷Ca2+-ATP酶和Na+，K+-ATP酶，激活Na+-Ca2+交換機制，Ca2+大量內流，激活蛋白酶(如鈣蛋白酶和磷脂酶)，這些酶會誘導細胞膜通透性發生改變和細胞骨架蛋白膜磷脂的水解，最終導致細胞壞死[32]。此外，針對IRI腎臟細胞壞死途徑的研究發現，細胞壞死主要由細胞質受體蛋白激酶3、細胞質受體蛋白激酶1和混合譜系激酶結構域樣蛋白的相互作用介導，通過敲除小鼠細胞質受體蛋白激酶3或混合譜系激酶結構域樣蛋白基因，可抑制細胞壞死，減輕缺血再灌注AKI，而利用細胞質受體蛋白激酶1活性抑制劑Nec-1(necrostatin-1)預處理的小鼠，可以提高小鼠缺血后的存活率，減輕缺血再灌注AKI[33]。

4 自噬與缺血再灌注AKI

自噬是一個依賴于溶酶體的分解代謝過程，消除老化細胞器和大分子蛋白質，為細胞器的更新和細胞修復提供營養代謝支持[34]。自噬作為細胞應對生存壓力的一種自適應防御，在維持細胞穩態過程中發揮關鍵作用[35]。在IRI過程中，近端腎小管上皮細胞中自噬體和自溶體高表達，自噬對IRI中細胞存活和細胞死亡起重要作用。

自噬的激活可以對缺血再灌注AKI的腎小管上皮細胞提供保護。研究表明，自噬的發生具有時間依賴性，而且其誘導時間早于細胞凋亡的發生，激活自噬有助于缺血再灌注AKI的保護；雷帕霉素預處理激活自噬可減輕缺血再灌注AKI，抑制細胞凋亡，改善腎功能；相反，抑制自噬可使腎小管細胞凋亡增加，腎功能惡化[34]。與野生型小鼠相比，端粒酶基因敲除損傷哺乳動物雷帕霉素靶蛋白介導的自噬信號后，IRI小鼠腎功能的恢復顯著延遲[36]。缺血預適應促進自噬作用，可減輕缺血再灌注AKI，而使用氯喹和3-甲基腺嘌呤抑制自噬卻加重了IRI后腎小管細胞凋亡[37]。通過削弱近端腎小管中的腺苷酸活化蛋白激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號轉導通路可抑制自噬的激活，加劇缺血再灌注AKI，而激活近端腎小管細胞發生線粒體自噬，則減弱了IRI過程中的腎臟損傷[38]。另外，高壓氧治療可以通過激活細胞自噬對IRI大鼠腎臟模型起到保護作用[39]。因此，細胞自噬可以對IRI導致AKI的腎臟組織發揮有效的保護作用。

另一方面，自噬的過度激活可導致AKI加重，抑制過度自噬可以改善缺血再灌注AKI。中性粒細胞明膠酶相關脂蛋白可誘導腎小管上皮細胞過度自噬，加重缺血再灌注AKI[40]。成纖維細胞生長因子-10可抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白介導的過度自噬，緩解缺血再灌注AKI大鼠模型的腎功能[41]。氯化鋅可減輕內質網應激，減少自噬相關蛋白Beclin-1和溶酶體關聯膜蛋白2的表達，改善缺血再灌注AKI的炎癥反應[42]。此外，微RNA也可抑制自噬，減輕缺血再灌注AKI[43]。對缺血性腎纖維化小鼠模型的研究顯示，自噬最初與近端腎小管的反應是適應性的，過度自噬最終會導致適應不良[44]。

因此，自噬作為一種新發現的程序性細胞死亡形式，對IRI后腎小管上皮細胞的存活和死亡具有重要意義。自噬是一把“雙刃劍”，自噬的激活在缺血再灌注AKI過程的早期具有保護作用，而過度自噬激活在缺血再灌注AKI過程的晚期則可促進細胞凋亡和細胞死亡。細胞自噬的調節有望成為AKI治療的重要干預靶點。

5 小 結

缺血再灌注AKI的機制包括經典的腎臟微血管改變以及由腎血管內皮細胞、腎小管上皮細胞和白細胞(如中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)介導的炎癥反應。細胞凋亡、壞死等方面機制的研究也為缺血再灌注AKI提供了更新的潛在治療靶點。此外，自噬是AKI新興的研究方向，自噬對IRI后細胞存活和死亡具有重要意義。自噬的保護或損害功能取決于細胞自噬激活的時間和數量。充分理解缺血再灌注AKI的發生機制，并針對其病理生理過程進行干預，可以為AKI的臨床預防和治療提供幫助，進而降低AKI患者的腎臟損傷，提高生存率。