腸道微生態與肝硬化

宦 徽 劉 超 唐承薇

人體腸道內定植有大量微生物，以細菌為主，同時也包括古生菌、病毒、原生動物等其他微生物。腸道菌群作為人體內最大的微生物貯藏庫，可與宿主互利共生，一定程度上影響人類的生理健康狀況。在健康的人體中，腸道菌群可幫助人體消化食物，提供豐富的必需營養物質(如生成維生素、增加必需營養物質的生物利用度等)，抵御腸道病原體入侵、與黏膜免疫系統相互作用，發揮免疫調節作用等。因此，人體內的腸道菌群可被看作為一個虛擬但又必不可少的“器官”。

傳統的觀念認為健康的人類胚胎在無菌環境中生長。近期有證據表明，孕期子宮內的羊水就已存在細菌，盡管其數量較少、微生物多樣性相對欠豐富[1]。出生后，新生兒所接觸的微生物及其衍生物持續暴增。不同的生產方式，極大地影響了新生兒的微生物群落組成。此外, 人體宿主的遺傳背景、年齡、免疫系統的發育、藥物、飲食習慣如飲酒、吸煙等因素均可影響腸道菌群的組成和功能。人體微生物作為相互作用的動態體系，具有極為復雜的特點，不僅個體間存在菌群多樣性，甚至同一個體的不同部位腸道菌群的構成也存在一定程度的差異。

正常成人腸道微生物呈相對穩定狀態，這種狀態一直持續到老年。總體來說，成人體內微生物總數多達40000種，其總體基因組比人類基因組超出100倍。其中在菌門層面上，擬桿菌門和硬壁菌門為健康成人的主要菌門。目前越來越多的證據顯示，腸道菌群失調如腸道微生物種屬豐度、多樣性和(或)組分改變均可能導致多種疾病的發生，如一系列的肝臟疾病、原發性硬化性膽管炎、炎癥性腸病等[2～4]。不同的疾病是否顯示了相對獨特的腸道微生物組變化，尚需開展深入的研究進一步明確。

一、腸道菌群的研究方法

人們對成人腸道菌群的認識最早來源于傳統微生物培養方法，然而此方法敏感度低，且目前有超過70%的細菌因難以鑒定種屬或不能提供優化的培養生長環境而無法培養。因此，僅僅依賴于微生物培養的方法不足以徹底了解腸道固有菌群的完整情況。近年來，DNA測序和分子生物學的快速發展，使得微生物16s核糖體RNA基因序列分析成為微生物研究的主要方法。而高通量測序技術的出現，不僅能夠完整地描述復雜的微生物組分，同時使大規模發現新的微生物群成為可能。而基于大規模人群的全微生物組——人類微生物組計劃可從腸道菌群結構及功能代謝方面出發，整體宏觀的深入研究健康成人腸道微生物組情況。

在腸道微生物的系統進化研究中，肝硬化菌群失調比例(the cirrhosis dysbiosis ratio, CDR)被用來判斷定值菌和非定值菌的比例，即有益菌與侵襲菌之比[5]。其中以雙歧桿菌與腸桿菌比值評分體系最為常用，其比值能有效區分肝硬化與健康成人，而且還可用于評估肝硬化患者出現并發癥的風險，因此目前被廣泛運用于臨床試驗中。

二、肝硬化中的腸道微生物

肝臟與消化道相鄰，70%的供血來自于門靜脈，這一特殊的解剖位置(肝-腸軸)，可導致肝臟特異性與經消化道運輸的營養物質相互作用，持續暴露于大量的細菌及其產物中。在腸道菌群分類構成方面，大量研究顯示，不同病因所致的肝硬化患者不僅具有相似的糞便腸道微生物群落，而且與健康人比較，肝硬化患者腸道菌群普遍表現為有益菌(如毛螺菌科、擬桿菌門)減少，同時潛在致病菌比例增多(如鏈球菌、腸桿菌科、腸球菌科、葡萄球菌科等)[6～10]。其中，基于中國漢族人口的一項研究發現，肝硬化患者腸道菌群的最大改變是口腔細菌菌種大量侵入消化道，推測可能與胃酸分泌減少，防御屏障破壞有關[9]。還有研究發現,肝臟疾病惡化時，肝硬化患者的腸道菌群也會隨之改變，其中微生物基因組中豐度較高的細菌種屬與疾病的嚴重性有明顯關系[11]。筆者推測肝硬化的疾病分期或許是決定微生物組成分豐度的一個重要因素。值得注意的是，在酒精性肝硬化患者的大便中發現普雷沃菌科基因豐度高于乙肝相關性肝硬化患者[12]。推測酒精相關性病因或許可影響終末期肝臟疾病患者的腸道菌群組成，但這一推斷需進一步的研究證實。

此外，國內的一項研究通過宏基因組定量分析顯示15個腸道微生物基因具較高的特異性，因而推薦這些微生物基因用來作為肝硬化的生物診斷指標，這或許可為肝硬化的監測和預防提供新的思路[9]。然而，考慮到缺乏這些微生物基因在不同疾病中的敏感度和效益研究，因此真正將腸道菌群作為腸內或腸外疾病診斷的生物學指標或藥物療效的評估指標，還有一定的距離，需設立更多合理的臨床研究。

其次，傳統觀念中的有益菌如厚壁菌門中可能存在致病菌，如葡萄球菌科和腸球菌科，這兩者在肝硬化患者中的基因表達豐度異常增多，因此有研究認為對于腸道菌群基于菌門水平的分析不適于肝硬化的微生物組研究[13]。目前的臨床研究之間，在研究方法上無統一標準，如研究收集的標本從大便樣本、腸腔抽吸物、腸道分泌物、腸道黏膜,到唾液等均有涵蓋。其中，大便標本因容易收集，故在腸道菌群的研究中最為常用，但往往僅能反應腸腔內微生物情況。而腸道黏膜的微生物作為腸道生物膜結構，與其下的腸道上皮層密切接觸，更能反映腸道固有定植菌特點。腸道黏膜表面黏附微生物和管腔內微生物組成存在區別，且可能在生態系統中發揮不同的作用。因此，基于不同人體樣本的臨床試驗，可導致不同研究之間微生物組構成分析產生異質性。

還需注意的是，在細菌基因水平上，肝硬化的病理特征或許應從微生物組基因豐度變化和功能兩方面進行具體描述，然而目前的研究多側重于肝硬化患者腸道菌群的宏觀構成，存在功能研究明顯不足。肝硬化與腸道微生物之間的關系，是互為因果，亦或是肝臟疾病調控腸道細菌改變，或是腸道菌群失調是導致肝硬化的發生原因，目前尚無定論。

三、腸道菌群在肝硬化中的機制研究

1.膽汁酸代謝:膽汁酸的肝腸循環可介導肝臟和腸道相互聯系，即初級膽汁酸在腸道細菌的作用下轉化為次級膽汁酸，由末端回腸重吸收回肝臟，再與結合膽汁酸一同經膽道排入腸道。例如擬桿菌屬可產生膽酸鹽水解酶，后者可促進初級膽汁酸轉化為次級膽汁酸。這一過程，同時也為擬桿菌屬細菌提供了能量。然而，在進展期肝硬化患者的糞便中，總膽汁酸的含量較正常人減少了5倍，其中次級膽汁酸與初級膽汁酸比例下降的最為明顯[14]。目前認為因進入腸道內的膽汁酸減少，導致如腸桿菌科等致病菌群和促炎性微生物組過度生長，而依賴于脫羧基功能的菌群減少[15]。此外，韋榮球菌屬在肝硬化患者中的異常增多，可水解聚合的膽鹽，阻礙腸道中微膠粒形成，最終導致消化道中的脂肪酸等脂肪代謝產物不易被腸黏膜吸收，膽汁進而淤積，最終加重肝硬化。膽汁酸的微生物調控作為腸道微生物與宿主相互作用的重要機制，除了影響肝臟疾病，同時也參與代謝綜合征的發病過程。

2.小腸細菌過度生長:目前的研究發現在肝硬化患者中，總膽汁酸減少可能導致小腸細菌過度生長的發生。如在肝硬化大鼠模型中，予以結合膽汁酸治療的大鼠，可出現腸道細菌過度生長和細菌移位明顯減少的現象。小腸細菌過度生長作為在肝硬化患者中常見的現象，其病理因素除膽汁酸減少這一原因外，還包括小腸蠕動異常，腸道轉運延遲，腸道通透性增加，抗菌防御減弱，小腸細菌過度生長等。此外，小腸細菌過度生長還與內毒素血癥、病理學細菌移位的發生有關，不僅可導致腸道細菌感染如自發性細菌性腹膜炎的發生率升高，同時還可增加肝臟疾病失代償的風險[16]。

3.病理性細菌移位:細菌移位被定義為活微生物或其產物如脂多糖、細菌DNA等通過腸道屏障從腸腔遷移進入腸系膜淋巴結及其他腸外器官。雖然目前的觀點將小腸細菌過度生長視為促使病理學細菌移位發生的主要因素，然而在肝硬化動物模型中僅僅出現小腸細菌過度生長，不足以導致細菌移位的發生。還需連同其他因素如局部免疫下降等，協調作用最終才可導致這一病理過程的發生。移位的細菌最為常見的為腸桿菌、糞腸球菌屬和變形菌屬等[16]。移位的細菌及其片段可通過釋放細胞因子和一氧化氮引發炎性反應，最終導致血流動力學的紊亂。而腸道內固有定植菌的減少，可導致短鏈脂肪酸、抗菌肽合成減少，腸道黏膜屏障相應遭受破壞，進而引起一系列病理反應如炎癥、門脈高壓等出現。

4.內毒素：肝硬化患者中腸道細菌過度生長及細菌移位均可導致韋榮球菌屬和腸桿菌科在結腸中顯著增多。革蘭陰性菌的異常增多可導致內毒素生成明顯增加。肝硬化患者因肝臟庫普弗細胞清除功能降低，消化道通透性增加，連同門-體側支循環形成，均導致血中內毒素水平明顯升高。

5.其他因素如全身性和局部性免疫防御受損可能也參與這一機制過程，但目前相關的研究較為匱乏，且缺少相應有效的研究方法。事實上，肝硬化患者菌群失調的風險較高，推測可能是多因素協調作用的結果。

四、腸道菌群在肝硬化的主要并發癥中發揮的作用

1.肝性腦病：人們對腸道菌群在肝臟疾病中作用的了解，最早來源于肝昏迷與腸道的含氮代謝產物之間存在聯系的發現。目前在肝硬化腸道微生物的研究中，大部分研究都側重于對肝性腦病的研究。總體來說，有肝性腦病病史的患者的大便和唾液樣本中均發現非固有定植微生物數量增多，而固有定植微生物數量減少的現象[7,11]。進一步研究發現，產堿菌科或卟啉單胞菌增多與HE患者所表現出的認知能力差明顯相關；而腸桿菌科與肝性腦病患者的炎癥有強相關性[6]。還有研究發現腸球菌、巨型球菌、克雷伯菌屬與肝性腦病患者的認知能力和炎性反應有關[7]。有趣的是，在動物模型中定植有某些細菌的腸道微生物能夠通過影響神經元回路參與對運動和行為的控制[17]。通過微生物-腸道-腦軸，腸道細菌可通過生成氨以及內毒素驅使的炎性反應，協同參與肝性腦病的發展過程[18]。此外，還有研究認為微生物產生的物質如酚類、短鏈或中鏈脂肪酸等可能也參與這一發病過程[19]。

2.自發性細菌性腹膜炎：腸道中細菌過度生長和(或)腸道細菌移位被認為是自發性細菌性腹膜炎的重要發病機制。研究發現，盡管這些肝硬化患者的腹腔積液微生物培養為陰性且未被診斷為自發性細菌性腹膜炎，近50%的酒精性肝硬化患者的腹腔積液中可檢測出細菌DNA，且與在肝臟標本中所發現的移位細菌一致[8]。目前認為，引起自發性細菌性腹膜炎的細菌大都為革蘭陰性桿菌如大腸桿菌和腸桿菌科的部分成員[6,12]。

五、治療措施

1.抗生素:在肝硬化的管理中，調控腸道微生物是一種可取的治療手段，現階段的研究多偏重于對肝性腦病的療效分析。目前主流的治療手段是使用吸收較差的抗生素如諾氟沙星和利福昔明以達到腸道凈化的作用[5]。諾氟沙星不能完全被腸道吸收，對需氧性革蘭陰性菌敏感，且很少引起耐藥。而利福昔明全身毒性弱、不易耐藥，可調節革蘭陽性菌，減少腸道細菌產生脂多糖。在動物模型中，與對照組小鼠比較，使用利福昔明治療的小鼠門脈壓降低，肝纖維化程度明顯降低[20]。臨床試驗中也發現利福昔明在肝性腦病和亞臨床肝性腦病中可明顯改善患者的認知功能，并減少肝性腦病的發生[21]。自從美國藥品監督管理局批準利福昔明可用于治療肝性腦病以來，人們對利福昔明更為關注。然而有研究發現利福昔明并不能改變腸道菌群本身，推測其療效可能歸因于對致病菌產生的代謝產物的調節作用[22]。因此，為明確這些抗生素在肝臟疾病中對微生物組和微生物-宿主相互作用的具體作用及影響，尚需更多的研究去明確。

2.益生菌:近幾年來越來越多非抗生素治療手段被應用于肝臟疾病，如益生元(食物補充或直接添加)、益生菌等。其中，益生菌作為目前研究的熱點，其療效的主要機制包括調節腸道微生物及改善腸道屏障等作用機制。盡管在肝前性門脈高壓動物模型中，乳酸菌發酵的奶制品沒能達到有效減少細菌移位發生的研究結局。然而，在輕癥肝性腦病動物模型中，研究發現益生菌混合物能夠有效降低肝性腦病的發生，降低血氨和內毒素水平，并且可明顯緩解肝臟損傷和炎性反應[22]。近期基于臨床隨機對照試驗的Meta分析顯示，益生菌在治療肝性腦病中存在一定的希望，但因不同研究之間存在明顯的偏移及隨機誤差，尚不能明確得出益生菌有效的結論。目前的研究之間存在益生菌使用濃度、療程、肝臟疾病嚴重性異質的現象，且缺乏益生菌對特異性腸道菌群組分影響的研究。因此，進一步的臨床試驗需著重研究益生菌對腸道微生物具體成分的影響與其臨床療效的相關性分析，并最終明確益生菌在肝臟疾病中的最佳有效劑量。

六、展 望

肝硬化患者菌群失調的風險較高，考慮與多因素協調作用的有關。腸道菌群在肝硬化的主要并發癥中發揮著重要作用，然而目前大部分研究僅停留在微生物的變化這一表觀現象，且主要集中在屬水平層面。精準到種水平的宏基因組學將是未來研究的重要方法，這可為展現肝硬化腸道微生物的多樣性、功能活性、種群結構、進化關系等提供更多細節信息。聯合蛋白及代謝組學等方式，可進一步探究腸道菌群在肝硬化中的機制作用。益生菌在治療上目前尚不能得出明確有效的結論。因此有賴于更多隨機、大樣本、多中心、高質量的研究，分析益生菌對腸道微生物具體成分的影響與其臨床療效，為臨床提供更多可靠依據。