HIV病毒庫研究進展新探究*

戴文敏 崔媛媛 舒占鈞,2,3

1 新疆醫科大學，新疆烏魯木齊市 830000； 2 新疆醫科大學第四臨床醫學院； 3 新疆維吾爾自治區第六人民醫院

當今社會經濟飛速發展，人們的思想及生活方式都發生了很大的變化，同時也增加了一些疾病發生的風險，艾滋病就是其中之一，它的患病人數正在逐年增加，其死亡率仍令人恐慌，據聯合國艾滋病規劃署(UNAIDS)估計，截至2017年底，全球現存活HIV/AIDS患者3 690萬例，當年新發HIV感染者180萬例，有2 170萬例正在接受高效聯合抗反轉錄病毒聯合治療[1]。目前全球公認的用于治療艾滋病的HAART療法可以達到抑制HIV病毒復制，減少艾滋病毒血癥的目的，但感染HIV病毒是終身的，需要長期口服抗病毒藥物來控制病情。人們在了解艾滋病毒感染過程方面取得的進展，以及從癌癥和基因工程等其他生物醫學領域的疫苗開發中獲得的見解，推動著艾滋病毒治療研究的迅速發展。近年來，關于艾滋病的治療方法研究分別在免疫治療，基因治療及新型藥物開發等方面都取得了成果，為未來清除HIV病毒庫實現艾滋病的功能性治愈做出了一定程度的貢獻，本文回顧了如何消除HIV病毒庫的最新進展。

1 HIV DNA庫對HIV病毒庫的意義

目前研究指出越早啟動抗逆轉錄病毒治療(ART)對降低免疫激活和病毒庫大小都有影響，從而產生所謂的功能性緩解。艾滋病毒感染者必須終身堅持抗逆轉錄病毒治療，因為潛伏感染的細胞含有轉錄沉默的整合原病毒，這使它們能夠避免免疫檢測，這些潛伏感染的細胞中有一部分是具有復制能力的整合前病毒，構成了潛伏的病毒庫[2]，廣泛存在于感染HIV病毒宿主的各種細胞和組織中。來自非人類靈長類動物(NHP)研究的證據表明，潛伏期在感染后3d內形成，早期發現和治療可能不足以防止潛伏期的形成。雖然許多類型的細胞被認為是艾滋病毒前病毒宿主，但靜息的CD4+T細胞被認為是最主要的細胞類型[3]。在大多數研究中HIV DNA的數量與病毒載量呈正相關，由于HIV DNA整合在宿主基因中使HIV病毒庫持續存在[4]。所以精確測定直接定量細胞相關的整合和非整合艾滋病毒DNA，有助于密切監測艾滋病毒的增殖能力。即使病毒被抑制，對于未經治療的原發性HIV感染，HIV總DNA水平是一個獨立的疾病進展預測因子。

雖然關于HIV病毒庫大小與HLA基因型之間關系的報道不多見，但研究顯示具有HLA保護性的宿主HIV DNA水平基線低，其原因之一是初期感染受到特異性CD4+T細胞的控制，另外歸因于抗體依賴細胞介導的細胞毒性可以降低和控制細胞相關HIV DNA的數量。目前人類白細胞抗原(HLA)多態性與HIV病毒庫之間的關系尚未完全理清，以后這一領域的更多研究可以為疫苗設計提供相關機制研究，并識別潛在的細胞毒性T淋巴細胞表位。強有力的證據表明[5]，人類無癥狀復制皰疹病毒科介導免疫激活，并與抗逆轉錄病毒治療期間較高水平的艾滋病毒DNA相關。此外，巨細胞病毒的存在與治療和未治療個體的HIV DNA水平呈正相關。可能的原因如下[6]：CD4+T細胞活化程度越高，抗原特異性越強，為重新播散HIV病毒庫提供了新的靶細胞。細胞因子和趨化因子水平的升高也會刺激炎癥和免疫激活。其他病毒的持續存在改變了免疫環境，使艾滋病毒庫變得更加多樣化，最終影響其衰變。HIV DNA在不同記憶T細胞亞群中的半衰期不同；干細胞樣、中央記憶、過度記憶和效應記憶T細胞分別為277、144、133和88個月。一些特殊的細胞亞群，如Th17和T濾泡輔助細胞，在未經治療的個體和接受長期治療的個體中對HIV病毒庫的持續存在起著重要作用。無論是接受治療的患者還是未接受治療的患者，HIV DNA庫的組成和發育都是由病毒特征、免疫系統和治療策略組成的綜合機制決定的。所以研究HIV DNA病毒庫的大小對促進HIV病毒庫的清除有重要意義。

2 HIV病毒庫檢測方法

最近發現細胞內或血漿中HIV RNA或DNA水平的定量仍然是描述病毒庫最常用的測量方法。盡管這些檢測方法有效且高通量，但它們無法區分具有復制能力或缺陷的部分，也無法量化感染細胞的數量。病毒生長測定法為能夠產生感染性病毒的細胞比例提供了一個較低的界限，但這些測定法費時、昂貴，而且大大低估了具有復制能力的原病毒潛伏庫。現有一些新的檢測方法可以克服這些問題，總的來說，有以下幾種類型，這些檢測方法包括[7]：細胞內HIV DNA，細胞相關HIV RNA，超敏血漿病毒血癥，病毒生長檢測結果檢測，誘導HIV RNA，蛋白檢測，小鼠過繼轉移檢測。然而，測量病毒庫大小的最佳方法仍存在爭議，我們要想制定艾滋病治療戰略需依賴于準確和精確地量化剩余艾滋病毒庫的規模。目前研究表明通常需要將檢測方法組合起來才能更全面地了解病毒庫大小。量化艾滋病細胞相關DNA水平的技術具有高通量但明顯高估了完整或真實病毒庫大小。雖然QVOA方法歷來被認為是衡量復制能力病毒庫規模的金標準，但該法在實施方面具有挑戰性，而且只適用于確定病毒庫規模及復制能力的下限。通過測序來量化完整前病毒的數量，似乎是目前對HIV病毒庫潛在真實大小的最佳估計，但鑒于它相對較新且耗時耗資，并不適用于大型臨床研究的推廣。較新的單細胞檢測艾滋病毒表達細胞和高通量量化艾滋病毒蛋白水平的方法是有前景的技術，但仍需要去尋求更多實際的驗證。所以對于HIV病毒庫的檢測我們仍需去探索一種快速、高通量的檢測方法，實現精準量化具有復制能力的艾滋病毒庫的水平以輔助艾滋病治療。

3 HIV病毒庫的消除研究

目前最有希望的消除策略是shock and kill，該法利用藥理學試劑將病毒庫中可誘發和感染的HIV病毒庫休克轉化為轉錄活性，從而通過免疫或治療機制對其進行檢測和消除。由于病毒庫的細胞特性，因此，CD4T細胞往往是潛伏期逆轉錄劑(LRAs)的目標[8]，以尋求清除潛伏病毒，目前，最熱的LRAs是非特異性組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)，最近，體外潛伏期逆轉研究使用兩種藥物方案，包括HDACi和蛋白激酶C(PKC)激動劑，已顯示協同放大潛伏期逆轉，提供有效shock是可以實現的。此外，某些HDACi可能通過抑制細胞因子釋放、延時殺死活化的感染CD4+T細胞、受損的CTL功能以及NK細胞的不必要凋亡來抑制免疫反應，它還對B細胞具有免疫調節作用，并抑制初級生發中心反應，所以為促進病毒庫的根除對于新的LRAs的研究是必要的。

最初有研究[9]表明T濾泡輔助細胞輪廓的T細胞可以作為淋巴結中主要的病毒細胞群，隨后進一步探索了T細胞的功能的極化如何影響其作為病毒庫的能力，從而發現調節性T細胞似乎能夠作為病毒庫，Honeycutt等人使用了一個人源化的骨髓小鼠(MoM)模型，由于宿主動物(NOD/SCID小鼠)不能指出人類T細胞發育，因此只有髓細胞和B細胞被人類細胞系統重組。ART治療成功抑制了血漿病毒載量，但部分感染母體(33%，n=3)在治療后出現反彈，基于這一結果，作者估計MoM中受感染的巨噬細胞的半衰期相當短(1.05d，而HIV-1感染的CD4T細胞的半衰期為2.4d)在接受抗逆轉錄病毒治療1周后，它們的數量將減少1%，這一結果加強了T細胞作為HIV-1長期抗逆轉錄病毒治療的主要宿主細胞群的貢獻。有學者假設特異性靜息記憶T細胞是最大的潛伏庫，他們對急性感染期接受治療的艾滋病患者的外周血單核細胞(PBMCs)進行了潛伏期逆轉研究[10]，構建了一個多價病毒樣顆粒(VLP)的配方，作為潛伏期逆轉激活載體(ACT-VEC)，他們隨訪了慢性和兒童隊列研究初步數據表明，ACT-VEC用于與HIV感染的CD4T細胞共同培養DC時，可導致HIV RNA的顯著轉錄。所以，ACT-VEC潛在的給藥和輔助策略的研究對未來ACT-VEC是否可以作為一種免疫啟動策略，促進治療的殺死方面仍需投入大量精力去研究。

樹突狀細胞(DC)是一類特殊的抗原呈遞細胞，Kristoff[11]及同事報告了一項關于樹突狀細胞一種亞型的作用的創新研究，在治療慢性HIV感染抗原出現促炎型極化單核細胞衍生樹突狀細胞(MDC1)，作者發現巨細胞病毒和HIV抗原刺激的MDC1可以逆轉HIV-1在HIV感染的自體CD4T細胞中的潛伏期接受聯合抗逆轉錄病毒治療(cART)的個人。此外作者還報道了MDC1可以激活細胞毒性T細胞淋巴細胞(CTL)能夠殺死HIV感染細胞。這些研究人員使用來自cART個體的原始細胞來創建一個自體成熟DC亞型，作者證明了這兩種細胞都能介導新分離CD4+T細胞的潛伏期逆轉，并誘導能夠在體外清除感染細胞的效應細胞。現有多個報道證明基于DC的艾滋病毒免疫療法策略[12]，但仍面臨很多挑戰，關于如何實現足量制備自體DC，體內DC啟動的作用也是目前還在TLR7/9激動劑聯合試驗中探索，MDC1作為免疫療法是否能克服限制還待新的臨床試驗結果去證明。

在人類和恒河猴感染HIV/SIV期間，HIV的主要宿主細胞記憶CD4T細胞和巨噬細胞會在脂肪組織中累積。根據病毒的生長結果分析，脂肪細胞中的CD4T細胞被具有復制能力和傳染性的病毒潛伏感染，此外，脂肪細胞與CD4T細胞和巨噬細胞相互作用[13]，促進免疫細胞活化和炎癥，這可能支持艾滋病毒的持久性。與淋巴組織等其他主要宿主相比，脂肪組織中的病毒復制可能較少，但脂肪潛伏病毒的復制能力和傳染性與其他組織相當。由于脂肪組織的普遍性，脂肪細胞與CD4T細胞和巨噬細胞之間的炎癥相互作用，以及抗逆轉錄藥物的選擇性分布，將受感染的免疫細胞隔離在脂肪庫中，可能是艾滋病治療工作的一大挑戰。受感染的CD4T細胞和巨噬細胞在淋巴組織和非淋巴組織中不斷遷移，根據組織微環境的不同，艾滋病毒原病毒可以重新啟動復制或保持潛在狀態。最近，在小鼠肥胖模型脂肪組織中巨噬細胞和T細胞大量積累的開創性報道之后，對脂肪儲留免疫細胞的進一步研究提供了強有里的理論基礎，即認為這種免疫現象可能對艾滋病毒的發病機制和宿主動力學具有重要意義[14]。早期研究表明，免疫細胞與脂肪細胞之間的相互作用，特別是圍生期脂肪細胞，促進免疫激活和脂肪炎癥，提示脂肪細胞調控HIV復制的發病機制，拉希德等人[15]表明，艾滋病毒復制移植游離脂肪酸的脂類代謝途徑和產生人類感染的CD4T細胞一致，CD4T調節細胞是脂肪組織穩態的重要調節細胞，也是潛在HIV病毒庫。Mansfield等人的報告顯示，以高脂肪膽固醇和飽和脂肪酸飲食喂養的siv感染恒河猴的疾病進展和死亡增加[16-17]。隨著不斷對這些代謝途徑和免疫調節機制的不斷闡明，將其應用于艾滋病毒領域具有革命性意義，有助于加深對病毒復制、潛伏期和病毒庫中持續存在的理解，并提出新的治療方案。

綜上所述，要想早日實現艾滋病的功能性治愈，我們必須加深對HIV病毒庫的研究，雖然目前的檢測手段不能全面評估病毒庫的水平，但是我們可以聯合使用現階段的檢測手段，基于HIV DNA庫，ACT-VEC通路，樹突狀細胞以及脂肪組織等潛在病毒庫的研究對HIV病毒庫規模大小、代謝、分布進行評估，以期為未來艾滋病治療事業做出貢獻。