經顱直流電刺激促進小鼠腦缺血后海馬神經發生涉及NMDA受體上調

馬曉嬌，承歐梅，校 歡，宋 丹，蔣青松，邱紅梅

(重慶醫科大學 1.藥理學教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，2. 附屬第一醫院神經內科，重慶 400016)

急性腦缺血疾病因其極高的致殘率和死亡率，且多數幸存者通常伴有學習和記憶缺陷、認知功能障礙等后遺癥，為患者及其家屬帶來巨大壓力[1]。因此，改善腦缺血后遺癥，尤其是認知功能障礙是此類疾病治療的重點和難點。有研究發現，大腦在缺血損傷后會進行自身修復，神經發生則在自身修復中發揮著尤為關鍵的作用，也已成為目前研究的熱點之一。

神經發生主要是神經干細胞(neural stem cell，NSC)在一定條件下增殖、分化、遷移、整合，并恢復神經功能的過程[2]。最初認為神經發生僅在哺乳動物的胚胎期，而成年腦組織神經元是不再進行增生和分化的終極細胞[3]。然而，近年來研究發現，成年哺乳動物腦內的兩個區域也同樣存在內源性神經發生：側腦室的室管膜下(subventricularzone，SVZ)和海馬齒狀回(dentategyrus，DG)的顆粒細胞下層(subgranularzone，SGZ)[4]。但由于腦缺血后內源性神經發生的細胞數量較少，且存活率較低，缺血后的組織重構和功能恢復遠遠不足，因此，神經學一直致力于尋找有效的治療方法和藥物靶點，刺激內源性神經發生，更好地恢復患者的大腦功能。

經顱直流電刺激(transcranial direct current stimulation，tDCS)是一種運用恒直弱電流(一般小于2 mA)調節神經細胞活動的物理治療方式[5]，它通過微弱的直流電作用于大腦皮質，改變神經元膜電位的電荷分布，產生去極化或超極化現象，從而起到改變大腦皮質的興奮性，調控大腦功能的作用[6]。目前，臨床上tDCS多用于輔助康復治療，如腦卒中患者運動功能的恢復；動物實驗研究中tDCS多用于改善阿爾茲海默癥模型鼠的學習記憶功能障礙。對tDCS是否能夠影響小鼠急性腦缺血后海馬區內源性神經發生研究較少。

N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體參與調控中樞神經系統的生長發育，在學習和記憶功能的發育中尤為重要[7]。NMDA受體的亞基NR2a和NR2b在海馬和大腦皮層中高度表達，參與神經干細胞發育過程，如細胞遷移、促進神經元軸突和樹突的生成、激活突觸重建，影響神經發生恢復腦功能。那么，tDCS能否通過促進腦缺血小鼠海馬內源性海馬神經發生，改善學習記憶功能，該作用是否與其增強NMDA受體功能有關？因此，本研究擬采用雙側頸總動脈夾閉法(bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO)建立小鼠急性腦缺血模型，探索tDCS對急性腦缺血后海馬神經發生的促進作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU，批號：HMBF8725V，純度99%)；大鼠抗BrdU單克隆抗體、兔抗DCX單克隆抗體、兔抗NeuN單克隆抗體均購自英國Abcam公司；Dy Light488標記山羊抗兔IgG、Dy Light549標記山羊抗大鼠IgG購自美國abbkine公司；兔抗β-actin、NR2b多克隆抗體購自北京博奧森公司；兔抗NR2a單克隆抗體購自上海傲圖公司；其余試劑均為國產分析純。

1.1.2儀器 Morris水迷宮(深圳瑞沃德公司)；光學顯微鏡(Nikon，日本)；激光共聚焦顯微鏡(ZEISS，德國)；定量PCR儀(BIO-RAD，美國)；Denley Dragon Wellscan MK3酶標儀(Thermo，美國)；凝膠成像系統(Bio-Rad，美國)。

1.2 方法

1.2.1實驗動物與分組 清潔級雄性成年健康C57BL/6小鼠，體質量(24±2)g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(渝)2018-0003。120只小鼠隨機分為假手術組(Sham)、模型組(Model)，tDCS低、高劑量組(tDCS75和150 μA，即tDCSL和tDCSH組)，每組30只。其中Morris水迷宮每組隨機選擇6只，HE染色、免疫熒光染色、qRT-PCR、Western blot每組各4只。

1.2.2動物模型的制備[8]小鼠記錄體質量后3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，頸部皮膚用酒精仔細消毒后沿著正中剪開，暴露氣管，用玻璃分針從氣管兩側鈍性分離雙側頸總動脈，注意避免傷及迷走神經，動脈夾閉20 min后恢復血供，縫合傷口，Sham組僅分離雙側頸部總動脈不進行夾閉。

1.2.3實驗動物的給藥 如Fig 1所示，對小鼠進行電極的安裝并給予恢復期，用牙科水泥將陽極電極，即填充了棉花和銅線的內徑為2 mm的塑料管(接觸面積為3.14 mm2)，固定在右側額葉區(前鹵+2 mm，矢狀縫+1.5 mm)，陰極參考電極(接觸面積為5 cm2)通過粘性電極片固定于小鼠胸腹部，每次刺激開始前將電極用生理鹽水潤濕以降低電刺激阻抗。造模24 h后給予相應強度的tDCS，每天30 min，重復5 d后,間隔2 d，再次給予tDCS，每天30 min，重復5 d，總計10 d[9]。Sham組與Model組給予假刺激，即只連通電路不給予電流刺激。免疫熒光組小鼠在造模d 9～13各組給予腹腔注射BrdU(50 mg·kg-1)，每天1次，持續5 d。

Fig 1 Schematic diagram of mouse tDCS installation

A：Location of stimulation electrode (anode) in mouse brain; B：Electrode configurations in mice. The anodal electrode was installed onto the skull above the right frontal cortex,while the cathodal electrode was placed onto the ventralthorax.

1.2.4行為學測試[10]造模后d 28，每組6只小鼠進行Morris水迷宮實驗，在前5 d的定位航行實驗中，每天進行4次試驗，在每次試驗期間，四組小鼠分別從四個象限面向池壁放入水中，給予60 s尋找水下隱藏的平臺并記錄找到的時間，60 s內未找到的小鼠記為60 s并進行引導；d 6的探索實驗中，移去平臺，記錄60s小鼠穿越虛擬平臺的次數。通過頂置相機和行為跟蹤軟件記錄小鼠的移動。

1.2.5HE染色 造模后d 7，每組4只小鼠心臟灌注后進行取腦，腦組織用多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋后再(前囟3.3～4.5 mm)連續切片，片厚5 μm，用于HE染色[2]。顯微鏡下觀察海馬CA1區神經元細胞的形態結構并拍照。用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件計算正常神經元數目。

1.2.6BrdU免疫熒光 造模后d 14，每組4只小鼠心臟灌注后取腦，腦組織用多聚甲醛固定，蔗糖溶液梯度脫水后，再用冰凍切片機進行連續冰凍切片，片厚10 μm。切片甲酰胺修復、鹽酸變性、硼酸中和、Triton-x破膜、山羊血清封閉后加BrdU(1 ∶200)一抗過夜，暗室內加DyLight 594標記羊抗大鼠熒光二抗(1 ∶200)、DAPI染色后甘油封片。激光共聚焦顯微鏡觀察海馬DG區BrdU陽性細胞表達并拍照。用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件進行分析。

1.2.7DCX免疫熒光 造模后d 14，每組4只小鼠，按照前述BrdU免疫熒光的方法取材后獲得冰凍切片。切片冷丙酮固定、檸檬酸修復、Triton-x破膜、山羊血清封閉后加DCX(1 ∶200)一抗過夜。暗室內加DyLight 488標記羊抗兔熒光二抗(1 ∶200)、DAPI染色后甘油封片。激光共聚焦顯微鏡觀察海馬DG區DCX蛋白陽性表達并拍照。用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件進行分析。

1.2.8BrdU/NeuN免疫熒光 造模后d 28，每組4只小鼠，按照前述BrdU免疫熒光的方法取材后獲得冰凍切片。切片甲酰胺修復、鹽酸變性、硼酸中和、Triton-x破膜、山羊血清封閉后加BrdU/NeuN(1 ∶200)一抗過夜。暗室內加DyLight 594標記羊抗大鼠和DyLight 488標記羊抗兔熒光二抗(1 ∶200)、DAPI染色后甘油封片。激光共聚焦顯微鏡觀察海馬DG區BrdU/NeuN陽性細胞表達并拍照。用Image-ProPlus 6.0圖像分析軟件進行分析。

1.2.9逆轉錄定量PCR(qRT-PCR)檢測海馬NR2a、NR2b的mRNA表達 造模d 14，每組4只小鼠麻醉后斷頭取腦，冰上迅速分離雙側海馬組織，保存于液氮中，按照說明書提取海馬RNA，逆轉錄為cDNA后，以β-actin為內參，在實時熒光定量PCR儀上擴增進行反應，引物序列如表1所示。記錄循環閾值(Ct值)作為統計參數，mRNA的表達水平用2-ΔΔCt法進行計算。

Tab 1 Sequences of primers (5' to 3')

1.2.10Western blot檢測海馬NR2a、NR2b的蛋白表達 造模后d 14，每組4只小鼠麻醉后斷頭取腦，冰上迅速分離雙側海馬組織，保存于液氮中。提取蛋白后BCA法測定總蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠：電泳、轉印等步驟后[2]，加一抗β-actin(1 ∶2 000)、NR2a(1 ∶1 000)、NR2b(1 ∶1 000)，4 ℃過夜；洗膜，加二抗(1 ∶2 000)，室溫孵育2 h，洗膜后加ECL化學發光試劑顯影，用Image Lab 4.1進行圖像分析。

2 結果

2.1 tDCS對腦缺血小鼠空間學習記憶能力的影響如Fig 2所示，在定位航行實驗中，隨著訓練天數的增加，各組小鼠的平臺潛伏期均逐漸縮短。與Sham組相比，Model組小鼠從d 2起尋臺潛伏期顯著延長(P<0.01)；與Model組相比，tDCS高刺激治療組小鼠尋臺潛伏期顯著縮短(P<0.01)。在空間探索實驗中，與Sham組相比，Model組小鼠跨越平臺次數顯著減少(P<0.01)；與Model組相比，tDCS低刺激組在統計學上無顯著性差異；tDCS高刺激組顯著增加小鼠穿越平臺次數(P<0.01)。

Fig 2 Effect of tDCS on learning and memory functions after cerebral ischemia in

A：Escape latency time;B：The frequency of crossing the platform.**P<0.01vssham;##P<0.01vsmodel

2.2 tDCS對腦缺血小鼠海馬CA1區病理學的影響如Fig 3的HE染色所示，Sham組小鼠海馬CA1區神經元細胞排列緊密，飽滿，呈圓形，胞內結構清晰，染色呈藍色；而Model組神經元細胞排列紊亂，破碎，不規則，正常神經元細胞數目相比Sham組顯著減少(P<0.01)。tDCS治療后神經元形態得到改善，與Model組相比，tDCS低刺激組差異無顯著性；tDCS高刺激組正常神經元數目明顯增加(P<0.01)。

2.3 tDCS對腦缺血后海馬神經發生的影響如Fig 4A、B所示，與Sham組相比，Model組小鼠海馬齒狀回BrdU陽性細胞表達明顯增加(P<0.01)；給予tDCS治療后，兩個刺激組陽性細胞數均在Model組基礎上明顯增加(P<0.01)。如Fig 4C、D所示，與Sham組相比，Model組小鼠海馬齒狀回DCX蛋白陽性表達明顯增加(P<0.01)；與Model組相比，給予tDCS低刺激后，陽性表達在Model組基礎上進一步增加(P<0.05)；給予tDCS高刺激后，陽性表達明顯增加(P<0.01)。如Fig 4E、F所示，與Sham組相比，Model組小鼠海馬齒狀回BrdU/NeuN陽性細胞表達明顯增加(P<0.01)；給予tDCS治療后，兩個刺激組陽性細胞數均在Model組基礎上明顯增加(P<0.01)。

Fig 3 Effect of tDCS on pathological changes in hippocampus CA1 region of cerebral ischemia

A:Pathological changes in hippocampal CA1 region (×400);B:The count of CA1 neurons in hippocampus.**P<0.01vssham;##P<0.01vsmodel

2.4 tDCS對腦缺血后海馬NR2a、NR2b水平的影響如Fig 5所示，與Sham組相比，Model組小鼠NR2a的mRNA表達(P<0.05)和蛋白表達(P<0.01)均明顯增加；在給予tDCS低刺激后，NR2a的mRNA表達在Model組基礎上進一步增加(P<0.05)，而蛋白表達差異無顯著性(P>0.05)；在給予tDCS高刺激后，NR2a的mRNA表達和蛋白表達相比于Model組均明顯增加(P<0.01)。與Sham組相比，Model組小鼠NR2b的mRNA表達和蛋白表達均明顯增加(P<0.05)；給予tDCS治療后，高刺激組NR2b的mRNA和蛋白表達均在Model組基礎上明顯增加(P<0.01)。

3 討論

腦缺血性疾病是嚴重危害人類健康的常見病和多發病[11]。隨著醫學的飛速發展，急性腦缺血的治療逐漸取得巨大成果，但缺血性認知功能障礙，尤其是學習記憶功能障礙的治療問題仍需攻克。目前認為，腦缺血導致認知功能障礙，主要原因在于海馬CA1區神經元凋亡，而這種功能障礙恢復不良可能與缺乏足夠的新生神經元相關。神經發生是腦缺血后的自身修復，內源性神經干細胞被激活后發育成熟并替補受損神經元，促進神經功能恢復。因此，增加內源性神經元數目，促進神經發生可能是認知功能恢復的關鍵因素之一。本研究采用小鼠急性腦缺血模型，模擬急性腦缺血病的病理生理進程，研究腦缺血后內源性神經發生及tDCS的促進作用及可能機制。

隨著物理因子治療中樞神經系統疾病的安全有效性逐步提高，tDCS作為一種無創口、安全性高、適應癥廣泛，通過在靶部位施加微弱電流調節大腦功能的治療方式，在近些年逐漸成為研究熱點。tDCS在治療帕金森等神經和精神疾病展示出了極好的發展前景，但其是否對急性腦缺血后內源性神經發生有促進作用及其機制還尚不清楚。應用不同強度的tDCS刺激缺血后小鼠，通過觀察各項指標，以期證明tDCS可顯著促進缺血后小鼠的內源性神經發生以及腦功能恢復。

研究證實腦缺血后內源性神經干細胞在9～13 d為增殖高峰，28 d后分化為成熟神經元[12]。BrdU作為一種核苷酸類似物，具有比核苷酸更好的親和力，能夠在細胞增殖時替代核苷酸插入DNA鏈中，因此，可以通過外源性注射BrdU觀察神經干細胞增殖情況；DCX在腦生長發育中至關重要，在遷移和分化的神經元軸突上持續表達，常用來研究神經元前體細胞的遷移和分化[13]；神經元特異性核蛋白NeuN特異性標記成熟神經元，BrdU/NeuN雙標普遍用于標記新生的成熟的神經元。本研究中，腦缺血小鼠海馬HE染色顯示CA1區神經元細胞核不規則，呈固縮狀態，排列紊亂，結構不完整，數目明顯減少；Morris水迷宮尋臺時間明顯延長，穿越虛擬平臺次數明顯減少，這些結果提示腦缺血導致海馬神經元凋亡，且學習記憶功能顯著下降；同時，腦缺血小鼠的海馬齒狀回BrdU、DCX、BrdU/NeuN的陽性細胞表達均明顯增加，提示NSC被激活增殖、分化、遷移并發育為成熟神經元，腦缺血后海馬區出現神經發生，但結合Morris水迷宮結果提示雖然缺血后機體出現內源性神經發生以進行自我修復，但遠不足以改善缺血后認知功能的恢復。給予150 μA刺激強度的tDCS治療可明顯增加正常神經元數量，縮短尋臺時間，增加穿臺次數，這些結果提示高刺激強度的tDCS治療可明顯改善CA1區神經元病理損害并提高學習、記憶等認知能力；同時，BrdU、DCX和BrdU/NeuN陽性細胞數在Model組基礎上進一步顯著增加，內源性神經發生明顯增強，提示tDCS治療可能通過進一步促進內源性神經發生，從而恢復缺血后腦功能重建。

Fig 4 Effect of tDCS on hippocampal neurogenesis in cerebral

A:BrdU positive cells in the hippocampal dentate gyrus(100×); B: The count of BrdU positive cells;C:DCX positive cells in the hippocampal dentate gyrus(100×); D: The count of DCX positive cells; E:BrdU/NeuN positive cells in the hippocampal dentate gyrus(100×); F: The count of BrdU/NeuN positive cells.**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Fig 5 Effect of tDCS on mRNA and protein expression of NR2a and NR2b in hippocampus of cerebral ischemia

*P<0.05,**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

成年海馬神經發生受到網狀多靶點調控，其中NMDA亞基NR2a和NR2b參與突觸可塑性及記憶形成過程，在神經元發育過程中的樹突狀分支中起重要作用，從而發揮介導海馬神經生長的作用。本研究結果顯示，無論是模型組小鼠還是給予tDCS治療后的腦缺血小鼠其增強內源性神經發生作用均與NR2a和NR2b表達上調相關，提示NR2a和NR2b表達上調參與了缺血后內源性神經發生過程，而tDCS可通過進一步提高其表達，促進缺血后內源性神經發生，改善學習記憶功能障礙。

綜上所述，tDCS可促進急性腦缺血后小鼠內源性神經發生，從而改善學習記憶功能障礙，其機制可能與促進NR2a和NR2b表達上調有關。由于急性腦缺血參與因素的復雜性和tDCS作用的廣泛性，tDCS對急性腦缺血后小鼠的保護作用的參與機制仍需要進行更深入的研究。

(致謝：本文實驗在重慶醫科大學藥學院生物化學與分子藥理學重點實驗室完成，特此致謝！)