慢性間歇性低壓低氧對發育大鼠主動脈舒張的影響

李宏偉，宋麗莉，張 翼，董澤飛

(1.邢臺醫學高等專科學校生理教研室，河北 邢臺 054000；2.河北醫科大學生理教研室，河北 石家莊 050017)

大量研究表明[1]，慢性間歇性低壓低氧(chronic intermittent hypobaric hypoxia，CIHH)具有明顯的心血管保護效應。我們以往的研究顯示[2]，CIHH 對于缺血/再灌注引起的大鼠心肌損傷具有明顯的對抗作用。例如，CIHH 具有抗心律失常作用，并可促進心臟缺血/再灌注后心功能的恢復。CIHH 這種心臟保護作用可維持兩周左右時間，其機制可能與心肌抗氧化能力增強[3]、KATP通道的開放[4]、熱休克蛋白表達增強[5]、線粒體通透轉換孔開放抑制有關。此外，在自發性高血壓、腎血管性高血壓或代謝綜合征大鼠模型，CIHH 處理可明顯降低升高的動脈血壓。CIHH 這種抗高血壓作用可能與動脈血管的舒張增強，以及壓力感受性反射的易化有關。但 CIHH 對心血管功能的保護作用機制遠未完全闡明。

眾所周知，發育的幼年動物與成年動物在形態與功能各方面均表現出明顯差異，并且隨著動物年齡的增加，動物的大部分生理、生化指標都會發生改變[6]，例如動物功能、神經可塑性、對低氧的反應性等方面[7]。我們以往研究顯示，相同程度的 CIHH 處理對不同年齡大鼠可引起完全不同的作用。在成年大鼠，應用 4～6 周、每日 6 h、模擬 5 km 高原的 CIHH 處理可產生心臟保護效應，但對幼年大鼠則引起心臟損傷，而 4～6 周、每日 5 h、模擬 3 km 高原的 CIHH 可使幼年大鼠出現心臟保護作用[8]。這說明發育大鼠與成年大鼠對 CIHH 處理的反應性是不同的。同樣，在成年大鼠和成年腎血管性高血壓大鼠，我們發現 CIHH 可增強胸主動脈環舒張，但不知 CIHH 對發育幼年大鼠胸主動脈舒張作用如何。本研究旨在探討 CIHH 處理對發育大鼠胸主動脈舒張功能的影響及其機制。

1 材料

1.1 試劑苯腎上腺素(phenylephrine, PE)(貨號：P0398)，乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)(貨號：A2661)，吲哚美辛(indomethacin, Indo)(貨號：I7378)，格列苯脲(glibenclamide, Gli)(貨號：G0639)，以上藥物購自Sigma公司；四甲基哌啶氧化物(tetramethylpiperidinooxy, Tempo)(貨號：ALX-430-081-G001)，購自Alexis公司。藥物保存在 -20 ℃，使用藥物時，用二甲基亞砜配制 Gli，用蒸餾水配制其余藥物，用 K-H 液稀釋成浴槽所需濃度，所有藥物及液體都現用現配。

1.2 溶液K-H 液(mmol·L-1)：NaCl 118.0、KCl 4.7、CaCl22.5、MgSO41.2、NaHCO325.0、KH2PO41.2、glucose 11.0，pH 7.4。

2 方法

2.1 動物分組和間歇性低氧處理本研究中對動物的處置均參照《實驗動物護理和使用指南》進行，符合動物倫理學要求。實驗動物的使用、操作流程均經河北醫科大學實驗動物使用倫理委員會審查和批準。

實驗所用 Sprague-Dawlay 大鼠購自河北醫科大學實驗動物中心，♂，體質量(150～360) g，合格證號：708068，許可證號：SCXK(冀)2003-1-003。新生 Sprague-Dawlay ♂大鼠隨機分為 8 組：CIHH 處理組(CIHH)、CIHH 后1周組(CIHH-p1)、CIHH 后2周組(CIHH-p2)、CIHH 后3周組(CIHH-p3)、對照組(Con)、對照一周組(Con-1)、對照兩周組(Con-2)與對照三周組(Con-3)。CIHH 各組動物從出生前 1～3 d開始，隨母鼠一起置于低壓氧艙內，接受每天5 h，模擬海拔 3 km 的低壓低氧處理，共 42 d。對照組動物除不接受低壓低氧處理外，其余與 CIHH 處理組動物相同。每周定時記錄動物體質量及一般狀況。

2.2 離體動脈環制備動物麻醉使用戊巴比妥鈉，腹腔注射法(50 mg·kg-1)。麻醉后，取出胸主動脈，置于 K-H 液中，剪成動脈環(長約 3 mm)。將動脈環用細不銹鋼絲(0.1 mm)穿起，浸泡在恒溫浴槽內(成都儀器廠，浴槽內有 5 mL K-H 液，溫度保持在 37 ℃，持續通入 95% O2和 5% CO2混合氣)，將動脈環一端和張力換能器相連，利用 BL-420E+ 生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)，記錄標本的張力變化。

2.3 離體動脈環舒張描記

2.3.1動脈環活性判定 將動脈環的初始張力調節為 1 g，每 20 min更換一次浴槽內的 K-H 液。初次平衡 40 min后，檢測標本活性。先使用 PE(10-6mol·L-1)，誘發動脈環收縮，然后給予 ACh (10-5mol·L-1)，使血管環舒張，若舒張反應大于 70%，則被判定為動脈環內皮完整。

2.3.2常氧條件下的動脈環舒張 內皮完整的動脈環，沖洗換液后再平衡 40 min，通過累加給藥觀察血管環反應。先用 PE(10-6mol·L-1)使動脈環再次收縮，其收縮反應的最大值被記錄為 Emax，然后依次累加給予 ACh(10-9～10-5mol·L-1)，觀察血管環舒張效應，記錄下各濃度 ACh 誘發的動脈環舒張值，和 Emax相比較，計算出舒張反應的相對值(%Emax)，并繪制量-效曲線圖。

另外，對部分 CIHH 組大鼠內皮完整的動脈環，記錄最大收縮值 Emax后，直接沖洗換液后平衡 40 min，分別給予 Indo(10-5mol·L-1)、Gli(10-5mol·L-1)或者 Tempo(10-6mol·L-1)，30 min 后，給予 PE(10-6mol·L-1)使動脈環收縮后，同樣以累加給藥法給予 ACh(10-9～10-5mol·L-1)，觀察常氧條件下 PE 收縮后 ACh誘發的血管舒張情況受前列環素、KATP通道和氧自由基的影響。

2.3.3急性低氧條件下的動脈環舒張 常規處理動脈環后，記錄 PE(10-6mol·L-1)使動脈環收縮的最大值，沖洗換液平衡 40 min，再次給予 PE(10-6mol·L-1)使動脈環收縮，以累加給藥法給予 ACh(10-7～10-5mol·L-1)誘發舒張。在此次給予 PE 前 20 min 改為持續通入 95% N2和 5% CO2混合氣導致 K-H 液中氧濃度降低，觀察急性低氧對動脈環舒張的影響。

同樣，對部分 CIHH 組大鼠內皮完整的動脈環，記錄最大收縮值 Emax后，平衡 40 min，觀察急性低氧條件下 PE 收縮后 ACh 誘發的血管舒張情況受前列環素、KATP通道和氧自由基的影響。

3 結果

3.1 CIHH對發育大鼠胸主動脈舒張的影響常氧條件下，由 ACh(10-7mol·L-1濃度以上)誘發的胸主動脈環內皮依賴性舒張反應在 CIHH 處理組大鼠較對照組大鼠明顯增強，且呈濃度依賴性，隨著 ACh 濃度的增加，增強作用更加明顯。CIHH 處理大鼠的量-效曲線較對照大鼠明顯向左下移位(P<0.05)。結果表明，CIHH處理對發育大鼠胸主動脈舒張具有明顯增強效應。

Fig 1 Relaxation in isolated aorta ring induced by ACh (10-9～10-5 mol·L-1) under normoxia n=6)

Representative tension curve from CIHH (A) and CON (B). Comparison of ACh-induced thoracic aorta relaxation between CIHH and control groups (C). All data were expressed as a percentage of the contraction caused by PE (10-6mol/L).*P<0.05vsCon

3.2 CIHH動脈舒張增強效應的維持時間CIHH 處理后各組大鼠胸主動脈環舒張均明顯大于各自對照組大鼠，顯示 CIHH 對動脈舒張的增強效應在 CIHH 處理后3周依然存在。結果表明，CIHH 對發育大鼠動脈舒張增強效應至少可維持3周時間(P<0.05)。

Fig 2 Duration of ACh-induced (10-9～10-5 mol·L-1) thoracic aorta relaxation post CIHH groups

ACh-induced (10-9～10-5mol·L-1) thoracic aorta relaxation of one-week (A), two-week (B) and three-week (C) post CIHH groups under normoxia. All data were expressed as a percentage of the contraction caused by PE (10-6mol·L-1).*P<0.05vsCon

3.3 吲哚美辛，格列本脲和Tempo對CIHH動脈舒張增強效應的影響為探討 CIHH對發育大鼠胸主動脈舒張增強效應的產生機制，我們在累加給予 ACh 前分別給予 Indo(10-5mol·L-1)、Gli (10-5mol·L-1)和 Tempo(10-6mol·L-1)30 min 預處理。結果表明，CIHH 對發育大鼠胸主動脈舒張增強效應可被 Indo、Gli 和 Tempo 完全阻斷(P<0.05)。

Fig 3 Effect of Indo, Gli and Tempo pre-treatment on ACh-induced (10-7～10-5 mol·L-1) thoracic aorta relaxation of CIHH and control groups under normoxia n=6)

All data were expressed as a percentage of the contraction caused by PE (10-6mol·L-1).*P<0.05vsCIHH

3.4 急性低氧對CIHH動脈舒張增強效應的影響急性低氧條件下，由 ACh 誘發的大鼠胸主動脈環內皮依賴性舒張反應明顯減弱，其量-效曲線明顯向左下移位(P<0.05)。CIHH 處理組與 Con 組大鼠相比較，CIHH 處理大鼠動脈環舒張減弱的程度明顯小于 Con 組大鼠(P<0.05)，此作用可被 Indo 和 Tempo 所消除(P<0.05)。結果表明， CIHH 處理減輕急性低氧對動脈舒張功能的抑制，抑制作用與前列環素和氧自由基有關。

4 討論

本研究應用離體動脈環張力描記方法，首次觀察 CIHH 處理對發育大鼠離體主動脈環 ACh 誘發的內皮依賴性舒張的影響及其機制。結果顯示，CIHH 可明顯增強發育大鼠胸主動脈 ACh 誘發的內皮依賴性舒張，此效應可維持至少 3 周時間，并可被 Indo、Gli 和 Tempo 所阻斷。結果提示，CIHH 對血管內皮依賴性舒張增強作用與前列環素、ATP 敏感鉀通道(KATP)和氧自由基有關。此外，研究結果亦顯示，CIHH處理可對抗急性低氧對血管舒張的抑制，從而進一步證實 CIHH 對血管功能的保護作用。

血管內皮細胞覆蓋于血管內表面，在維持血管的收縮舒張之間的平衡等方面具有十分重要的意義。ACh 可通過血管內皮細胞產生 NO，通過 NO-cGMP 途徑，導致血管舒張[9]。通常以 ACh 誘發的血管舒張衡量 NO 所介導的血管內皮依賴性舒張功能。有研究報道，CIHH 可通過增加 NO 發揮心血管保護作用[10]。本研究結果顯示，CIHH 對 ACh 誘發的主動脈舒張具有明顯的增強效應，提示 CIHH的增強血管舒張作用可能通過增加血管內皮 NO 產生所實現。

Fig 4 Relaxation in isolated aorta ring induced by ACh (10-7～10-5 mol·L-1) under acute hypoxia n=6)

Representative tension curve of relaxation in isolated aorta ring induced by ACh (10-7～10-5mol·L-1) from CIHH (A) and CON (B) under acute hypoxia. Comparison of ACh-induced thoracic aorta relaxation between acute hypoxia CIHH and acute hypoxia control/normoxia CIHH groups (C). All data were expressed as a percentage of the contraction caused by PE (10-6mol·L-1).*P<0.05 CIHH under acute hypoxiavsCIHH under normoxia,#P<0.05 CIHH under acute hypoxiavsCon under acute hypoxia

Fig 5 Effect of Indo, Gli and Tempo pre-treatment on ACh-induced (10-7～10-5 mol·L-1) thoracic aorta relaxation of CIHH and control groups under acute hypoxia n=6)

All data were expressed as a percentage of the contraction caused by PE (10-6mol·L-1).*P<0.05vsCIHH

前列環素(prostaglandin，PG)是一種舒血管物質，在環氧合酶等的作用下，會形成前列環素(PGI2)。PGI2可通過刺激腺苷酸環化酶(AC)，使血小板中 cAMP增加而抑制血管平滑肌收縮，導致血管舒張[11]。本研究結果顯示，應用環氧合酶的非特異性抑制劑吲哚美辛預孵育動脈環，可以阻斷 CIHH 處理對 ACh 誘發的主動脈內皮依賴性舒張增強效應，提示 CIHH 的增強主動脈舒張作用可能與血管內皮環氧合酶作用增強、或者 PG 合成與釋放增多有關。

K+通道可調節血管平滑肌收縮，在調節血管張力中發揮重要作用[12]。本研究結果顯示，應用 KATP非特異性抑制劑格列苯脲預孵育動脈環可以阻斷 CIHH 處理對ACh 誘發的血管內皮依賴性舒張增強效應，提示 CIHH 對主動脈舒張的增強效應可能與促進 KATP通道開放有關。我們以往的研究也已證實，CIHH 增強成年大鼠血管舒張作用可通過激活阿片受體，從而促進 KATP通道開放所引起[13]。

本研究結果顯示，對大鼠主動脈的舒張增強效應可被氧自由基清除劑 Tempo 所取消，表明 CIHH 對主動脈舒張增強效應與體內自由基產生有關。有研究報道[14]，自由基參與在缺血預處理等心臟保護作用的信號轉導通路，通過自由基清除劑清除自由基后可消除心臟保護作用。聯系本研究結果，可以推測 CIHH 作為一種應激刺激，可導致體內一定程度的氧自由基增加，通過自由基參與的信號轉導通路，引起 NO產生增加，從而增強血管的舒張反應，以及對抗急性低氧對血管舒張的抑制。

綜上所述，CIHH 處理具有增強發育大鼠胸主動脈舒張并對抗急性低氧對動脈舒張的抑制，CIHH 對動脈舒張的保護作用可能與前列腺素生成增多、KATP通道開放及氧自由基作用有關。