小膠質(zhì)細(xì)胞在金花茶多糖保護(hù)腦出血中的作用

田 寧，向文靜，周紫賢，蔣艷林，陸美蓮，文 劍，廖儒佳,4

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1. 神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室、2. 廣西神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心、3. 廣西腦與認(rèn)知重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、 4. 神經(jīng)內(nèi)科、5. 藥學(xué)部，廣西 桂林 541004)

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一種突然起病的血液循環(huán)障礙疾病，臨床上表現(xiàn)為一過性或永久性的功能障礙，是腦卒中的重要類型，患者多死于腦出血早期并發(fā)癥[1]。中國腦出血致死患者約占腦血管病致死患者61.7 %，已成為我國首要致死疾病[2]。盡管ICF1病理生理研究已取得巨大進(jìn)步，但有效治療手段尚局限于超早期止血、控制顱內(nèi)高壓、溶栓和神經(jīng)保護(hù)藥物應(yīng)用等。從療效上看，腦出血的病死率、復(fù)發(fā)率仍然很高，并發(fā)癥、后遺癥仍很多[3]。目前研究顯示，腦出血后繼發(fā)性腦損傷是其主要損傷機(jī)制，包括紅細(xì)胞降解產(chǎn)物的神經(jīng)毒性、炎癥反應(yīng)、腦水腫、血腦屏障的破壞以及補(bǔ)體系統(tǒng)的激活等，其中炎癥反應(yīng)是腦出血后繼發(fā)性損傷的重要病理生理過程[4]。炎性反應(yīng)是導(dǎo)致腦出血后多種細(xì)胞死亡、繼發(fā)神經(jīng)功能障礙重要原因。多個研究均發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞是參與中樞炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞類型。腦損傷后多種因子刺激小膠質(zhì)細(xì)胞激活，使處于靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞極化，更多轉(zhuǎn)化為具有神經(jīng)毒性的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞極化過程是指靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞受到某些因子刺激后發(fā)生形態(tài)與功能變化，轉(zhuǎn)化為經(jīng)典M1型小膠質(zhì)細(xì)胞和可變M2型小膠質(zhì)細(xì)胞。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放炎癥因子發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞釋放抗炎因子及調(diào)控細(xì)胞吞噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。多個研究指出，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放多種具有神經(jīng)毒性的細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)α及IL-6、IL-8等。上述因子通過激活血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞，改變內(nèi)皮細(xì)胞抗凝狀態(tài)，損傷內(nèi)皮細(xì)胞、增加血管通透性，導(dǎo)致某些重要神經(jīng)毒性分子釋放，如花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物、氮氧化物等，以及調(diào)節(jié)粘附分子并促進(jìn)其他炎癥因子表達(dá)等加重?fù)p傷。因此，將激活后的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有神經(jīng)保護(hù)作用的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞可能是減輕腦出血后繼發(fā)性腦損傷的重要途徑。

金花茶多糖(camellia nitidissima polysaccharides，CNP)由廣西特有植物金花茶提取提純。之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)金花茶多糖具有調(diào)血脂，降糖等功效[5-6]，而其在中樞的作用尚未見報道。本課題探索金花茶多糖在腦出血中的作用及可能的作用機(jī)制，為金花茶多糖作為腦損傷的一種潛在治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF級♂ 8～12周齡C57BL/6小鼠，體質(zhì)量 (25±3)g, 購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司(許可證號：SCXK(湘) 2016-0002), 所用動物實(shí)驗(yàn)方法與處理措施均由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)并執(zhí)行。

1.2 試劑與儀器金花茶多糖由桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院鄒登峰教授提供；IL-6、IL-1β和TNFα的ELISA檢測試劑盒(南京建成生物工程公司，批號分別為E20160628、20171134B、20170945B)；伊文思藍(lán)粉末購于源葉生物科技有限公司；IBA-1多克隆抗體(批號66827-1-Ig) 購于Proteintech公司；CD206(批號29c3790)、CD16抗體(批號88e2569) 均購于Affinity Biosciences公司； PCR相關(guān)試劑(Takara公司，美國); 腦立體定位儀、高速顱骨磨鉆(瑞沃德生命科技有限公司，深圳) ，實(shí)時定量PCR儀(ABI/7500Fast, 美國)；冰凍切片機(jī)(Thermo NX50，美國)；酶標(biāo)儀(BioTek/ELx808，美國 )；熒光顯微鏡(Leica DM4B，德國)；曠場實(shí)驗(yàn)平臺(欣軟科技，上海)

1.3 基底節(jié)腦出血模型構(gòu)建腦出血采用自體血注射法。♂ C57BL/6小鼠通過10% 水合氯醛麻醉，腦立體定位儀上固定，以右側(cè)腦基底節(jié)進(jìn)針點(diǎn)，位置為前顱起，前后: -0.0 mm，左右: +1.0 mm, 深度： -3.0 mm。抽取小鼠尾動脈血30 μL注入，骨蠟封閉并縫合。對照組采用相同的方法注入等量生理鹽水，其余處理相同。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物分組與給藥將小鼠隨機(jī)均分為 3組: 假手術(shù)組(Sham組) 、模型組 (ICH 組) 、金花茶多糖組 (CNP組) ，金花茶多糖組在腦出血模型成功后灌胃給予金花茶多糖(500 mg·kg-1)，在腦出血后即刻給予及此后連續(xù)3 d。假手術(shù)組給予等體積生理鹽水。

1.5 神經(jīng)功能缺陷評分 (neurological deficit score, NDS)參考文獻(xiàn)采用28分評分法。具體如下：身體對稱性(0～4分)，步態(tài)(0～4分)，45度攀爬實(shí)驗(yàn)(0～4分)，轉(zhuǎn)圈實(shí)驗(yàn)(0～4分)，前肢對稱性(0～4分)，強(qiáng)迫轉(zhuǎn)圈(0～4分)，觸須反應(yīng)(0～4分)。0分為正常，4分為嚴(yán)重障礙。綜合以上分?jǐn)?shù)為該實(shí)驗(yàn)最終得分，以綜合得分在5～15分作為納入標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 運(yùn)動功能評價通過曠場實(shí)驗(yàn)評價各組小鼠運(yùn)動功能情況。曠場設(shè)備由開口的方形盒子構(gòu)成(長×寬×高為：45 cm×45 cm×45 cm) 。將小鼠面朝一個特定的方向放入曠場箱中央，讓其自由探索10 min。并通過軟件進(jìn)行運(yùn)動軌跡的自動追蹤和小鼠的運(yùn)動路程、運(yùn)動速度等參數(shù)的分析，最后通過對應(yīng)軟件統(tǒng)計小鼠的運(yùn)動量。

1.7 感覺功能評價通過粘附移除實(shí)驗(yàn)評價各組小鼠感覺功能情況。將小鼠置于一曠場內(nèi)熟悉1 min，在其左右前爪分別粘貼一塊1 cm×1 cm的膠布，再將其輕放于曠場內(nèi)開始計時，以120 s為上限統(tǒng)計其將兩塊膠布移除的潛在時間。

1.8 ELISA檢測取損傷灶及損傷周邊腦組織100 mg，按50 mg ∶1 ml加入冷生理鹽水，冰浴下勻漿5 min，于4 ℃下2 000 r ·min-1離心15 min，分離出上清，取1 ml均分2份，置于-80 ℃冰箱待測。IL-1β、TNF α和IL-6用ELISA試劑盒檢測，具體操作按說明書進(jìn)行，結(jié)果以10-5g·g-1濕重腦組織表示。

1.9 免疫組化染色術(shù)后24小時，將小鼠麻醉，用預(yù)冷的生理鹽水灌流后，再用4%的多聚甲醛固定，30%的蔗糖溶液脫水。當(dāng)樣本徹底脫水后即開始切片，厚度為20 μm。PBS洗腦片，每次5 min，共3次。驢血清室溫封閉腦片2 h，加入相應(yīng)一抗4 ℃過夜。PBS清洗，每次5 min，共3次，加入相應(yīng)的二抗后室溫孵育2 h。PBS清洗，每次5 min共3次，最后封閉液封片，在熒光顯微鏡下觀察。

1.10 實(shí)時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR)總RAN提取試劑盒提取總RNA后，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過特定引物與熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR檢測。PCR特定引物如下： IL-6引物序列如下: forward primer (5′-GGCGGATCGGATGTTGTGAT-3′)、reverse primer (5′-GGACCCCAGACAATCGGTTG-3′)。 IL-1β引物序列如下: forward primer (5′-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3′)、reverse primer (5′-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3′)。IL-10引物序列如下: forward primer (5′-TCAAGGATGCACATCAAAAGGC-3′)、reverse primer (5′-AGGCAGCAACTTCCTCCCT-3′)。BDNF引物序列如下: forward primer (5′-TCATACTTCGGTTGCATGAAGG-3′)、reverse primer (5′-AGACCTCTCGAACCTGCCC-3′)。內(nèi)參GAPDH 引物序列如下：forward primer (5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′)、reverse primer (5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′)。

1.11 腦出血后含水量測定腦出血3 d后小鼠經(jīng)乙醚深度麻醉后斷頭取腦，采用干濕重法測量含水量。經(jīng)大腦中線切開，去掉嗅葉與小腦后稱量大腦濕重。然后把大腦于100 ℃條件下烘干72 h。根據(jù)濕重(WW)與干重(DW)，按照下列公式計算大腦含水量: 大腦含水量/%=(WW-DW) /WW×100%。

1.12 Evans Blue檢測血腦屏障的通透性通過伊文思藍(lán)染料 (evans blue dye，EB) 來評價血腦屏障的通透性。方法如下：小鼠腹腔注射4%的EB 無菌生理鹽水溶液250 μl，3 h后處死小鼠灌流，分離大腦備用。勻漿，4 ℃，12 000 r·min-1離心30 min，上清液與三氯乙酸等體積混合后4 ℃過夜。4 ℃，12 000 rpm 離心30 min，取上清液，于620 nm 波長下采用紫外可見分光光度計測定其吸光度。根據(jù)已知EB溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本EB的含量，EB濃度表示為pg·g-1組織重量。EB標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：采用50%三氯乙酸為校零標(biāo)準(zhǔn)品，按1 ∶3比例加入無水乙醇。使用50%三氯乙酸配制不同濃度(50、1 000 mg·L-1) 的EB 溶液，于620 nm 波長下采用紫外可見分光光度計測定其吸光度。

2 結(jié)果

2.1 金花茶多糖顯著減輕腦出血急性期神經(jīng)功能損傷評分如Fig 1所示，為探索金花茶多糖在腦出血中的作用，我們采用了小鼠自體血注射構(gòu)建腦基底節(jié)出血模型，并在腦出血后即刻，以及每天連續(xù)給藥3 d，并對各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，結(jié)果顯示腦出血后整體神經(jīng)功能下降，而給予金花茶多糖后3 d后可改善整體神經(jīng)功能。

Fig 1 Intracerebral hemorrhage (ICH) model

2.2 金花茶多糖顯著減輕腦出血急性期運(yùn)動功能，對感覺功能改善不明顯為進(jìn)一步評估金花茶多糖在腦出血中的神經(jīng)保護(hù)作用，我們在給予金花茶多糖3 d后，采用了曠場實(shí)驗(yàn)與粘附移除實(shí)驗(yàn)分別評估腦出血后的運(yùn)動功能與感覺功能。結(jié)果如Fig 2所示，與假手術(shù)組比，模型組的運(yùn)動功能與感覺功能均下降，而金花茶多糖組小鼠的運(yùn)動功能與模型組比均顯著改善，但感覺功能與模型組比無差異。

2.3 金花茶多糖顯著減輕腦出血急性期腦水腫及血腦屏障損傷腦水腫與血腦屏障損傷是腦出血急性期的典型病理特征。為進(jìn)一步證實(shí)金花茶多糖的神經(jīng)保護(hù)作用，我們通過腦水腫檢測與伊文思藍(lán)染色檢測給予金花茶多糖后腦出血周邊區(qū)組織的病理改變。腦水腫結(jié)果顯示模型組手術(shù)側(cè)明顯發(fā)生水腫，而金花茶多糖組與模型組比顯著減少腦水腫(Fig 3A)。伊文思藍(lán)染色結(jié)果顯示模型組發(fā)生血腦屏障損傷，而金花茶多糖組較模型組相比減輕血腦屏障損傷(Fig 3B)。

2.4 金花茶多糖顯著減輕腦出血急性期炎癥反應(yīng)腦出血急性期會產(chǎn)生典型的炎癥反應(yīng)，一些典型的炎癥因子包括IL-1β、TNF α和IL-6的表達(dá)顯著升高。Fig 4顯示腦出血3 d后模型組炎癥因子與假手術(shù)組比升高，而金花茶多糖組與模型組比減少炎癥因子的表達(dá)水平。

Fig 2 Neurological impairment in acute stages of ICH alleviated by

A. An illustrative example of mouse travel pathway on open field test for various groups and open field tests were evaluated three days after ICH; B. Quantitative analysis of the adhesive removal test three days after ICH.**P<0.01vsSham group;##P<0.01vsICH group.

2.5 金花茶多糖顯著抑制腦出血急性期小膠質(zhì)細(xì)胞激活既往報道顯示腦出血后的炎癥反應(yīng)與小膠質(zhì)細(xì)胞激活密切相關(guān)。因此我們檢測了小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況。Fig 5結(jié)果，顯示腦出血3 d后，在損傷周邊區(qū)模型組小膠質(zhì)細(xì)胞與假手術(shù)組比數(shù)量升高，且大多數(shù)細(xì)胞處于激活狀態(tài)，而金花茶多糖組與模型組比顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，但小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量無差異。

Fig 3 Brain edema and blood-brain barrier destruction in acute stages of ICH attenuated by

A. Quantification of brain water content three days after ICH; B. Quantification of EB in brain after perfusion with saline.**P<0.01vsSham group;##P<0.01vsICH group.

Fig 4 Neuroinflammation in acute stages of ICH

The levels of inflammatory factors in each group were detected using ELISA.**P<0.01vsSham group;##P<0.01vsICH group.

2.6 金花茶多糖促進(jìn)腦出血急性期活化小膠質(zhì)細(xì)胞基因型由M1型轉(zhuǎn)化為M2型為進(jìn)一步確定小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況，我們對極化后M1型與M2型進(jìn)行分析。Fig 6結(jié)果顯示，腦出血3 d后，在損傷周邊區(qū)模型組小膠質(zhì)細(xì)胞與假手術(shù)組比小膠質(zhì)細(xì)胞M1型比例升高，而金花茶多糖組與模型組比，小膠質(zhì)細(xì)胞M1型比例顯著下降，而M2型比例升高。

2.7 金花茶多糖抑制腦出血急性期小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面標(biāo)志物M1表達(dá)，促進(jìn)M2型表達(dá)已知小膠質(zhì)細(xì)胞極化后形成M1型后，小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面標(biāo)志物CD16/32表達(dá)升高，而小膠質(zhì)細(xì)胞極化后形成M2后，則小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面標(biāo)志物CD206表達(dá)升高。為進(jìn)一步驗(yàn)證金花茶多糖促進(jìn)了小膠質(zhì)細(xì)胞極化后更多地由M1型轉(zhuǎn)化為M2型，我們通過免疫熒光分別檢測M1型與M2型小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面標(biāo)志物CD16和CD206。Fig 7結(jié)果顯示，腦出血3 d后，損傷周邊區(qū)模型組與假手術(shù)組比，小膠質(zhì)細(xì)胞CD16和CD206表達(dá)均升高，但給予金花茶多糖后抑制了CD16的表達(dá)且進(jìn)一步促進(jìn)了CD206的表達(dá)。

Fig 5 Microglial activation in acute stages of

Representative immunofluorescence images and its binary images of microglial activation with IBA-1.

3 討論

腦出血是致死致殘率最高的疾病之一，腦出血后伴隨運(yùn)動功能、感覺功能、學(xué)習(xí)記憶等神經(jīng)功能損害給患者及社會帶來沉重精神與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[9]。現(xiàn)有研究顯示，腦出血急性期繼發(fā)性腦損傷是影響腦出血預(yù)后關(guān)鍵。包括血壓、炎癥、紅細(xì)胞降解產(chǎn)物、補(bǔ)體系統(tǒng)等是繼發(fā)性腦損傷關(guān)鍵因素，針對上述因素的調(diào)控均可顯著改善或減輕腦出血預(yù)后[10-11]。近期，一個腦出血重要的多中心Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，靶向紅細(xì)胞降解產(chǎn)物的藥物-甲磺酸去鐵胺(DFO)能一定程度改善腦出血患者功能(只是效果不如預(yù)期)[12]，該結(jié)果提示DFO聯(lián)合其它靶點(diǎn)藥物可能效果更好或其它病理過程可能更重要。本研究發(fā)現(xiàn)靶向腦出血后炎癥反應(yīng)可明顯減輕腦出血急性期神經(jīng)功能障礙，連續(xù)給予金花茶多糖可顯著減輕腦出血急性期多種炎癥因子包括IL-1β、TNF α和IL-6的表達(dá)，同時改善整體的神經(jīng)功能評分與運(yùn)動功能障礙。該結(jié)果也提示：① 金花茶多糖在腦出血后可能具有神經(jīng)保護(hù)作用；② 金花茶多糖可能是通過抑制炎癥反應(yīng)減輕腦損傷。

金花茶多糖來自于廣西特有國家一級保護(hù)植物金花茶提取物。現(xiàn)有研究顯示，其可通過抗氧化、抗炎減輕急性肝損傷，提高機(jī)體免疫力，降血糖等多種作用，然而其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用則尚未見報道，我們的研究證實(shí)了金花茶多糖在腦出血急性期具有神經(jīng)保護(hù)作用，同時可明顯減輕血腦屏障的損傷及減少腦水腫。后者可能是促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的重要原因，而金花茶多糖抑制炎癥反應(yīng)則可能是其改善血腦屏障損傷與減輕腦水腫的重要因素。本研究使用的金花茶多糖屬于混合產(chǎn)物，由包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖等在內(nèi)的多種單糖組成，而具體是哪種或哪幾種單糖起主要作用還有待進(jìn)一步研究。

腦出血后的炎癥反應(yīng)主要由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)。研究顯示腦損傷后4 h小膠質(zhì)細(xì)胞即可激活并分泌多種炎癥因子產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，該作用甚至可以持續(xù)數(shù)周。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后轉(zhuǎn)化為M1型是其發(fā)揮炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵[13]。因此，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活性，抑制其轉(zhuǎn)化為M1型是抑制腦出血后的炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。目前調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化，使其從促炎作用的M1型轉(zhuǎn)化為神經(jīng)保護(hù)作用的M2進(jìn)而改善神經(jīng)功能已經(jīng)在包括腦出血在內(nèi)的多種神經(jīng)損傷疾病中進(jìn)行了探索，如促進(jìn)某些基因如TSG-6，或小分子化合物如AG-490以及與天然產(chǎn)物提取物如姜黃素等均可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極性[14-15]。本研究也證實(shí)金花茶提取物-金花茶多糖可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由具有神經(jīng)毒性的M1型轉(zhuǎn)化為神經(jīng)保護(hù)作用的M2型，這可能是其抑制炎癥的關(guān)鍵原因之一。

Fig 6 Gene expression of M2 increased by CNP and gene expression M1 decreased by CNP in acute stages of ICH

Fig 7 M2 polarization enhanced by CNP and M1 polarization of microglia suppressed by CNP in acute stages of n=5～6)

Representative immunofluorescence staining for CD16 (A) and CD 206 (B) markers in brain sections. Quantification of the number of CD16 (C) and CD 206 (D) positive cells in brain sections.*P<0.05,**P<0.01vsSham group;##P<0.01vsICH group.

綜上所述，金花茶多糖可明顯減輕腦出血急性期神經(jīng)功能評分、改善運(yùn)動動能，減輕腦水腫與血腦屏障損傷，其神經(jīng)保護(hù)作用可能與其促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型轉(zhuǎn)化為M2型，抑制炎癥有關(guān)。本研究為充分發(fā)掘與開發(fā)廣西特色藥材金花茶提供理論依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝課題組老師同學(xué)的幫助和支持。)