天麻素對甲基苯丙胺誘導的神經元毒性損害的保護作用

閆倩文，石振金，張楓弋，周一卿，黃兆奎，王一航，張冬先，洪仕君，李利華

(昆明醫科大學法醫學院,云南 昆明 650500)

甲基苯丙胺(methamphetamine，MA)的濫用給人體健康和社會安定造成了極大地危害。目前，MA濫用人員呈低齡化趨勢，嚴重危害青少年身體健康。褪黑素(melatonin，MT)可通過調控下丘腦視上核交叉的沖動發放頻率來改善睡眠，具有抗氧化應激，保護線粒體，抗凋亡，還有調節免疫、抑制腫瘤生長、延緩衰老、降血壓及鎮痛等多重功效[1]。大量研究結果提示，MT可以緩解MA誘導的神經毒性損害。MT可通過降低MA介導的氧化應激起到保護作用，此外它還可以維持線粒體的穩態、降低神經炎癥因子等的表達[2]。體內研究表明，MT可以對抗MA暴露導致的高熱、多巴胺降低以及多巴胺轉運體的減少[3]。

天麻素(gastrodin，GAS)是云南特有植物藥物天麻最主要的活性成分。臨床上多用于治療頭暈、神經退行性疾病等。本課題組此前致力于研究天麻素在毒品戒斷方面的作用并取得初步研究結果[4-5]。本研究選取眾多研究確認對MA誘導的神經毒性損害有保護作用的MT作為陽性對照，探討天麻素對MA誘導的神經毒性損害的保護作用及其效果，為毒品戒斷治療藥物的篩選提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑鹽酸甲基苯丙胺由云南公安刑事科學技術研究所合法提供，配制成10 g·L-1(53.85 mmol·L-1)溶液(生理鹽水稀釋)，過濾除菌，4 ℃保存。天麻素由生物醫學研究工程中心陸地教授贈予，配制成10 g·L-1(33.86 mmol·L-1)溶液(生理鹽水稀釋)，過濾除菌，4 ℃保存。MT(Meilunbio 公司，MB1475-S)，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解為20 g·L-1，-20 ℃避光保存。聚-L-賴氨酸 氫溴酸鹽(Sigma公司，P2636)；DMEM培養基(Biological Industries公司，01-050)、胰酶(Biological Industries公司，03-050)；神經元培養基、B27 supplement、胎牛血清、雙抗、谷氨酰胺(Gibco公司)；DMSO(Solarbio公司，D8370)，DNA酶(Solarbio公司，D8071)，細胞增殖-毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)(Biosharp公司，BS350B)；細胞凋亡檢測試劑盒(Roche公司，11684795910)；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinasecysteinyl aspartate specific proteinase-3, caspase-3)抗體(兔抗，1 ∶200，Proteintech公司，19677-1-AP)； 神經元標志物(the class III β tubulin specific antibody, Tuj1)(鼠抗，1 ∶200，Proteintech公司，66375-1-Ig)；熒光二抗(DyLight 488, Goat anti-mouse IgG 1 ∶500，Abbkine 公司，A23210)；熒光二抗(Dylight 594, Goat anti-rabbit IgG，1 ∶500，Abbkine 公司，A23420)。

1.2 實驗動物SPF級24 h內新生SD大鼠，購于昆明醫科大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(滇)K2015-0002。

1.3 實驗儀器超凈臺(Thermo scientific公司)，二氧化碳培養箱(Thermo scientific公司),倒置顯微鏡(Leica公司)，全波長酶標儀(Thermo公司)，熒光顯微鏡(Leica公司)。

1.4 方法

1.4.1細胞培養 取SPF級24 h內新生SD大鼠，75%冷乙醇浸泡3～5min無菌條件下斷頸處死，取腦，顯微鏡下剝離腦膜，夾取皮質組織，剪碎，胰酶37 ℃消化10 min，終止消化后過濾，離心，加適量培養基重懸制成細胞懸液，細胞計數，按既定濃度接種于培養板，放入細胞培養箱培養4 h后換神經元培養基，3 d后給藥。

1.4.2不同濃度MA對皮質神經元活性的影響 細胞以4×105～5×105的接種密度接種于96孔板，培養72 h后加不同濃度MA溶液(0 mmol·L-1、0.125 mmol·L-1、0.25 mmol·L-1、0.5mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L-1)分別處理24 h，每組3個復孔。棄掉培養基，每孔加90 μL神經元培養基和10 μL CCK-8混合液，溫箱孵育2 h后測定細胞活力值。用全波長酶標儀測量波長450 nm的吸光度值，檢測不同濃度的MA對神經元活性的影響。

1.4.3不同濃度GAS對MA誘導的皮質神經元毒性損害的保護作用 皮質神經元培養3 d后，加不同濃度GAS(0 mg·L-1、12.5 mg·L-1、25 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1)分別處理2 h后，再給MA最佳給藥濃度作用24 h，每組3個復孔。用CCK-8試劑盒檢測細胞活力值，確定最佳干預濃度。

1.4.4不同濃度MT對MA誘導的皮質神經元毒性損害的保護作用 皮質神經元培養3 d后，加不同濃度MT(0、0.1、1、10、100 μmol·L-1),分別處理2 h后，再給MA最佳給藥濃度24 h。用CCK-8試劑盒檢測細胞活力值，確定最佳干預濃度。

1.4.5細胞免疫熒光技術、DNA斷裂的原位末端標記法(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)檢測細胞凋亡 培養細胞3 d后，隨機分為對照組、0.5 mmol·L-1MA組、25 mg·L-1GAS+0.5 mmol·L-1MA組、10 μmol·L-1MT+0.5 mmol·L-1MA組，每組3個復孔。棄掉培養基，用PBS洗滌3次×3 min；加1ml 4%多聚甲醛溶液固定15 min，然后滴加PBS 3次×3 min。取出爬片置于載玻片上，滴加含5%羊血清0.3%Triton的PBS(0.01mol·L-1)封閉液100 μL，37 ℃孵育30min；棄掉封閉液，滴加一抗(Tuj1抗體1：200，Caspase-3抗體1 ∶200)，4 ℃過夜。PBS漂洗3次×3 min；避光加入二抗(1 ∶500)和TUNEL反應混合液，37 ℃避光孵育1 h；漂洗3次×3 min；滴加含DAPI的抗熒光淬滅劑進行細胞核染色，室溫孵育3 min；將玻片倒扣在載玻片上，熒光顯微鏡觀察結果。

2 結果

2.1 各實驗組細胞活力值測定MA給藥組細胞活力值如Fig 1A所示，與對照組相比，0.5 mmol·L-1MA組、1 mmol·L-1MA組、2 mmol·L-1MA組細胞活力顯著降低(P<0.01)；0.5mmol·L-1MA組與0.125 mmol·L-1MA、0.25 mmol·L-1MA組相比皮質神經元細胞活力顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)；1 mmol·L-1MA組、2 mmol·L-1MA組細胞活力比0.5 mmol·L-1MA組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；據此確定MA最佳給藥濃度為0.5 mmol·L-1。

GAS+MA組細胞活力值如Fig 1B所示，與0.5 mmol·L-1MA組相比，25 mg·L-1GAS+0.5 mmol·L-1MA組細胞活力值顯著上升(P<0.01)；故選取25 mg·L-1作為GAS最佳干預濃度。

MT+MA組細胞活力值如Fig 1C所示，與0.5 mmol·L-1MA組相比，10 μmol·L-1MT+0.5 mmol·L-1MA組細胞活力值明顯上升(P<0.05)；故選取10 μmol·L-1作為MT最佳干預濃度。

2.2 不同實驗組的細胞形態改變

2.2.1不同MA劑量給藥組細胞形態改變 如Fig 2所示，隨著MA濃度增加，皮質神經元胞體逐漸皺縮，出現空泡化，甚至死亡；突觸也逐漸變短消失。當MA濃度為2 mmol·L-1時，細胞幾乎全部死亡，突觸消失。

2.2.2不同劑量GAS+MA給藥組細胞形態改變 如Fig 3所示，與對照組比較，MA組細胞數目減少，突觸變細小、斷裂；不同劑量天麻素干預后，有細胞形態呈不同程度改善。

Fig 1 Cell viability value of different experimental groups

2.2.3不同劑量MT+MA給藥組的細胞形態改變 如Fig 4所示，與對照組比較，MA組細胞皺縮，數目減少，突觸變短；不同劑量MT干預后細胞形態呈不同程度改善。

Fig 2 Morphological changes of cortical neurons after 24 h treatment with different concentrations of MA

A: Control group; B: 0.125mmol·L-1MA group; C: 0.25mmol·L-1MA group; D: 0.5 mmol·L-1MA group; E: 1mmol·L-1MA group; F: 2 mmol·L-1MA group. The arrow showed typical morphological changes of cortical neuron.

2.3 細胞凋亡率檢測細胞凋亡率檢測結果如Fig 5、6所示，與對照組相比，MA組TUNEL染色陽性細胞顯著增多(P<0.01)；GAS+MA組和MT+MA組的TUNEL染色陽性細胞比MA組顯著減少(P<0.01)；GAS+MA組和MT+MA組TUNEL染色陽性細胞經過計數和統計學處理，差異無統計學意義。說明對MA誘導皮質神經元細胞凋亡的干預影響，天麻素可達到與MT一樣的干預效果。

2.4 各實驗組Caspase-3的表達與對照組比較，MA組Caspase-3表達明顯增強；GAS+MA組和MT+MA組Caspase-3均比MA組明顯降低。Caspase-3染色陽性細胞，經過計數和統計學處理，差異無統計學意義。提示天麻素對MA誘導的皮質神經元細胞凋亡具有緩解作用，效果與MT相當(Fig 7)。

3 討論

已有的研究表明，MA可以導致多巴胺和5羥色胺能神經元終末端的損傷，軸突末端可發生腫脹、歪曲、退化等形態學改變；MA還可以導致細胞死亡，在額葉皮質、紋狀體、海馬等部位均檢測出細胞凋亡[6]。研究表明，氧化應激和線粒體功能障礙可能導致MA誘導的多巴胺能神經元細胞凋亡[7]。本研究選取檢測凋亡的TUNEL法染色和提示細胞凋亡的指標Caspase-3，比較天麻素和MT的干預效果。

Fig 3 Morphological changes of cortical neurons with different concentrations of gastrodin pre-treatment of 2 h and post-treatment of MA (0.5 mmol·L-1) for 24 h

A: Control group; B: 0.5 mmol·L-1MA group; C: 12.5 mg·L-1GAS+0.5 mmol·L-1MA group; D:25 mg·L-1GAS+0.5mmol·L-1MA group; E: 50 mg·L-1GAS+0.5 mmol·L-1MA group; F: 100 mg·L-1GAS+0.5 mmol·L-1MA group.

研究結果提示，隨著MA濃度增加，皮質神經元胞體逐漸萎縮，有的可見空泡樣結構，突觸逐漸變細、回縮、斷裂，消失。當MA濃度為2 mmol·L-1時，視野中細胞胞體幾乎全部失去原有正常形態，胞體萎縮、死亡，突觸消失。說明MA對皮質神經元已經造成明顯毒性損害作用。通過不同梯度濃度干預細胞后，檢測發現神經元的活力值與MA作用濃度呈負相關，MA濃度為0.5 mmol·L-1時，可對皮質神經元造成近半數致死的毒性損害。

MA在小鼠模型中可誘導神經元發生固縮、變性、壞死等病變，其程度與劑量和作用時間緊密相關[8]。MA的神經毒性雖已被公認，但其作用機制研究尚不明確，已有的研究結果主要涉及細胞凋亡、自噬、谷氨酸興奮性毒性、能量代謝、突觸可塑性、氧化應激等方面。

Fig 4 Morphological changes of cortical neurons with different concentrations of melatonin pre-treatment of 2 h and post-treatment of MA (0.5 mmol·L-1) for 24 h

A: Control group; B: 0.5 mmol·L-1MA group; C: 0.1 μmol·L-1MA+0.5 mmol·L-1MA group; D: 1 μmol·L-1MA+0.5 mmol·L-1MA group; E: 10 μmol·L-1MA+0.5 mmol·L-1MA group; F: 100 μmol·L-1MA+0.5 mmol·L-1MA group.

MT的神經保護作用機制也涉及多個方面。線粒體氧化損傷和蛋白激酶Cδ(一種蛋白激酶C家族亞型)過度表達，促成甲基苯丙胺誘導的多巴胺能變性，MT對MA介導的線粒體負荷(功能障礙)、氧化應激、促凋亡的保護作用和蛋白激酶Cδ有關[9]。還有研究發現，MA作用于血腦屏障引起炎癥反應而產生神經毒性，MT可以通過作用于MT受體，對MA介導的血腦屏障炎癥反應起到保護作用[10]。體內實驗研究表明，在小鼠MA依賴的模型中，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的活性降低，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞基NR2A和NR2B以及鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(CaMKII)表達改變，經過MT預處理后，可以減弱上述變化促進細胞增殖，實驗中發現ERK信號通路的活性下降[11]，課題組也正在開展相關的研究工作。Kongsuphol等[12]研究發現，MA抑制了哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的磷酸化以及下游靶蛋白的表達，MT預處理可以增強mTOR活性及其下游蛋白4E結合蛋白-1(eukaryotic trans-lation initiation factor 4E-binding protein 1，4EBP1)的活性，這也是我們后續研究跟進的方向。

Fig 5 Effects of gastrodin and melatonin pre-treatment for 2 h on cortical neuron apoptosis induced by MA treatment for 24 h

A: Control group; B: MA group; C:Gastrodin 25 mg·L-1+0.5 mmol·L-1MA group; D: Melatonin10 μmol·L-1+0.5 mmol·L-1MA group. DAPI (blue) staining showed the nucleus, Tuj1 (green) staining showed the cortical neuron cell, and TUNEL (red) staining showed the apoptotic cells.

Fig 6 Comparison of TUNEL staining positive cells of different experimental n=3)

**P<0.01vscontrol group,##P<0.01 MA group

本研究中，在MA給藥前2 h細胞用不同濃度的天麻素和MT分別預處理干預，再給藥MA作用24 h，發現天麻素和MT預處理后的神經元細胞活力有不同程度改善。天麻素干預組天麻素濃度為25 mg·L-1時細胞活力改善較明顯；MT干預組MT濃度為10 μmol·L-1時細胞活力改善最明顯，與先前報道的研究結果相一致[13]。在細胞凋亡實驗中，與對照組相比，MA組TUNEL陽性細胞增多(P<0.01)；與MA組相比，天麻素組、MT組TUNEL陽性細胞均減少(P<0.01)。與褪黑素組比較，天麻素組TUNEL陽性細胞計數差異無統計學意義，提示天麻素對MA介導細胞凋亡起到保護作用，且作用效果與MT相當。與對照組相比，MA組Caspase-3表達顯著增強，與先前的研究報道MA可以增強Caspase-3的活性表達結果一致[14]；經天麻素預處理干預后，可減弱MA誘導的Caspase-3表達增強。

Fig 7 Effects of gastrodin and melatonin pre-treatment of 2 h on expression of caspase-3 in cortical neurons treated with MA for 24 h

A: Control group; B: 0.5 mmol·L-1MA group; C:GAS 25 mg·L-1+0.5mmol·L-1MA group; D: MA 10 μmol·L-1+0.5 mmol·L-1MA group. DAPI (blue) staining showed the nucleus, Tuj1 (green) staining showed the cortical neuron cell, and caspase-3 (red) staining showed the apoptotic cells.

結合文獻報道，我們初步分析天麻素對MA誘導的神經毒性的干預機制。課題組先前的研究結果表明，天麻素可以減弱MA誘導SH-SY5Y細胞的自噬，且這種機制可能與Akt/mTOR信號通路有關[5]。天麻素還可以通過降低大鼠星形膠質細胞的活化，降低白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎性因子的表達改善MA導致的神經功能損害[4]。此外，韓學超等[15]研究提示，天麻素可抑制心肌細胞發生氧化應激損傷，最終通過減少凋亡來發揮一定的抗氧化應激損傷的作用。但是確認天麻素干預MA誘導的神經毒性損害機制是否與氧化應激有關，需要更多的證據來證實。

MA介導的神經毒性機制較為復雜，戒斷干預研究也尚在初期階段，本研究通過天麻素干預，發現天麻素對MA誘導的神經元凋亡有明顯的改善作用，提示天麻素對MA誘導的神經毒性損害有一定的干預效果，具體作用機制有待深入研究。