大豆苷元對人非小細胞肺癌A549、H1299細胞增殖、遷移能力的影響及機制

成 瓊，李 真，陳錦輝，向 錚，張獻偉，孔令非

(河南省人民醫院病理科，鄭州大學人民醫院，河南 鄭州 450003)

肺癌是最常見的惡性腫瘤，其新發病例和死亡病例均居世界第一，其中非小細胞肺癌約占全部肺癌患者的80%左右[1]。隨著我國工業化進程加快、環境污染加重、人口老齡化加劇，肺癌已成為我國發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，嚴重危害著大眾的健康和生命。近年來，盡管肺癌的治療手段已經取得了巨大進步，但是肺癌患者的5年生存率還是不到20%，究其原因就是肺癌的高侵襲力及高轉移性[2]。因此，抑制腫瘤細胞增殖、降低其侵襲及轉移是腫瘤患者治療的基礎。

我國中醫中藥用于治療腫瘤歷史悠久，因其具有多靶點、療效好、毒性低，已成為腫瘤藥物研發的重要來源之一[3]。大量實驗結果表明，來源于大豆異黃酮、葛根、亞麻籽等天然植物所含的植物雌激素，也具有預防和抑制腫瘤發生的作用[4]。植物雌激素主要分為異黃酮、木酚素、黃豆素以及真菌雌激素等四大類[5]。有研究發現，豆類食物因其含有的異黃酮類物質能減弱乳腺癌細胞增生。適當增加豆類食物的攝入量可降低乳腺癌和其他腫瘤的發生[6]。染料木黃酮及其前體物質禪寧A是植物雌激素的一種，對前列腺癌、胃癌、食管癌及直腸癌腫瘤細胞也有顯著抑制作用[7-8]。

大豆苷元(daidzein，Daid)屬異黃酮中的一種，與染料木黃酮同屬大豆異黃酮中活性最顯著的兩類[9]。目前，大量研究都集中在對染料木黃酮的研究，而大豆苷元的生物學作用研究鮮見報道。大豆苷元是否與大豆異黃酮類似，也有誘導癌細胞凋亡、抑制腫瘤遷移侵襲的作用？本實驗旨在體外觀察Daid對肺癌細胞株A549和H1299增殖及遷移的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人非小細胞肺癌細胞株H1299和A549均購自中國科學院上海細胞庫。于37 ℃水浴復蘇，移至培養皿中，加入適量含10%胎牛血清的培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養備用。

1.1.2試劑 DMEM高糖培養基購自Hyclone公司(貨號：SH30022.01，批號：AE25719272)，新生牛血清購自美國Gibco公司(貨號：10270106)。Daid購自Sigma公司(貨號：D7802，批號：077M4015V)，純度≥98%，以DMSO溶解后備用。牛血清白蛋白(BSA)購自美國Amresco公司(貨號：0332)。Cleaved Caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology公司(貨號：9665)。LC3Ⅱ/Ⅰ抗體購自美國Novus Biological公司(貨號：NB100-2220)。Transwell小室購自美國Corning公司(貨號：3422)。β-actin一抗(貨號：AF0003)、細胞裂解液(貨號：P0013B)、CCK-8試劑盒(貨號：C0037)、ECL反應液(貨號：P0018M)均購自碧云天生物科技有限公司，其他試劑為國產分析純。

1.1.3儀器 細胞培養箱(Thermo Scientific公司)；酶標儀(Thermo Scientific公司)；倒置相差顯微鏡(Olympus公司)；電泳儀、電泳槽及化學發光成像儀(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1CCK-8法檢測Daid對肺癌細胞株A549和H1299增殖的影響 將對數生長期的A549和H1299細胞以0.5×105/孔的密度接種于96孔培養板。待細胞貼壁后，加入終濃度分別為0、5、10、25、50、100、200 μmol·L-1的Daid預處理后，置于37 ℃，5%CO2培養箱培養，每個濃度組設5個復孔。48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL繼續培養4 h。酶標儀檢測各組A549和H1299細胞的吸光度值，計算細胞生長抑制率。

1.2.2細胞劃痕實驗檢測肺癌細胞株A549和H1299遷移能力 將處于對數生長期的A549和H1299細胞接種到6孔板中，控制密度在80%左右。待細胞完全貼壁后，加入終濃度為100 μmol·L-1的Daid，換用無血清培養基37 ℃培養過夜。在6孔板內每孔用槍頭劃兩條相互垂直的線，光學顯微鏡下觀察，拍攝各孔細胞0、6、12、18和24 h時間點細胞的劃痕狀態，并計算24 h細胞遷移率。遷移率/%=(劃痕面積0 h-劃痕面積24 h)/劃痕面積0 h×100%。

1.2.3Transwell小室實驗檢測肺癌細胞株A549和H1299遷移能力 A549和H1299細胞加入Daid預處理后，胰酶消化收集細胞，并用無血清培養基制成濃度為3×104個/mL的細胞懸液，取150 μL加入Transwell小室的上室，下室加入600 μL含有10% FBS的DMEM培養基，繼續在孵育箱中培養24 h。取出Transwell小室，甲醇固定0.5 h，結晶紫染色數分鐘，用濕棉簽擦去上室底部膜表面未遷移的細胞。倒置顯微鏡下隨機取5個視野拍照、計數及統計學分析。

1.2.4Transwell小室檢測肺癌細胞株A549和H1299侵襲能力 步驟同上，經Daid預處理的A549和H1299細胞用無血清培養基制成3×104·mL-1的細胞懸液。Transwell小室表面鋪50 μl Matrigel膠(DMEM培養基稀釋)，置于37 ℃培養箱中過夜以形成基質屏障膜。將Transwell小室放于24孔板中，Transwell小室下室中加入10% FBS的DMEM培養基。24 h后拍照、計數及統計學分析。

1.2.5Western blot檢測Caspase-3和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表達 PBS沖洗細胞2次，加入細胞裂解液，用細胞刮輕輕掛下貼壁細胞，收集至EP管中，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，吸上清獲取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。蛋白樣品用12% SDS-PAGE電泳跑膠后轉膜至PVDF膜上。BSA室溫封閉2 h后加入按1 ∶1 000稀釋的β-actin、Cleaved Caspase-3和LC3Ⅱ/Ⅰ抗體中4 ℃過夜。充分洗膜后加入適當稀釋比例的二抗，室溫孵育1 h，ECL顯影，化學發光成像分析儀中曝光。采用Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，計算各組目的條帶和內參條帶的比值，比較各組間的差異。

2 結果

2.1 Daid對肺癌細胞株H1299和A549增殖活性的影響Daid作用于肺癌細胞株48 h后，CCK-8法檢測不同劑量Daid對細胞增殖活性的影響。如Fig 1所示，與溶劑對照組(Daid 0 μmol·L-1)相比，Daid可明顯抑制H1299及A549的增殖能力，且抑制作用呈濃度依賴性(P<0.05)。

2.2 Daid對細胞劃痕愈合能力的影響Daid預處理48 h后，劃痕愈合實驗檢測Daid對細胞劃痕愈合速度的影響。實驗結果顯示，在0 h Control組和Daid組(100 μmol·L-1)細胞的遷移距離無明顯差異，而48 h后Daid組(100 μmol·L-1)相對于溶劑對照組細胞遷移距離有所減慢，差異有統計學意義(P<0.05)。提示Daid可抑制肺癌細胞的遷移能力。

Fig 1 Effect of Daid on proliferation of lung cancer A549 and H1299 cells

*P<0.05,**P<0.01vsControl

Fig 2 Effect of Daid on wound healing ability of

*P<0.05vsH1299-Control；**P<0.01vsA549-Control

2.3 Daid抑制肺癌細胞的遷移能力如Fig 3所示，在Daid作用于H1299、A549兩種肺癌細胞48 h后，Daid組遷移的細胞相對于Control組明顯減少。以Control組遷移細胞為100%計算，Daid組遷移細胞的百分比分別下降至51.5 %和72.2%，差異有統計學意義(P<0.05)。提示Daid對肺癌細胞的遷移能力具有重要調節作用。

Fig 3 Effect of Daid on migration of *P<0.05, **P<0.01 vs Control

2.4 Daid抑制肺癌細胞的侵襲能力實驗結果顯示，在Daid作用于細胞48 h 后，Daid組發生侵襲的細胞數量相對于Control組明顯減少，侵襲細胞的百分比下降至71.5 %和75.4%，差異有統計學意義(P<0.05)。提示Daid對肺癌細胞的侵襲能力也可能具有重要調節作用(Fig 4)。

2.5 Daid對肺癌細胞凋亡及自噬相關蛋白Cleaved Caspase-3、LC3 Ⅱ/Ⅰ表達的影響由Fig 5的Western blot結果表明，Daid(100 μmol·L-1)作用于H1299和A549兩種細胞株48 h后，與Control組比較，細胞中Cleaved Caspase-3蛋白表達明顯升高，LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表達也明顯升高(P<0.05)。

3 討論

目前，關于抑制腫瘤早期轉移方面的研究進展較為緩慢，究其原因是腫瘤的異質性及對腫瘤轉移機制的認識不清。在人類進入21世紀的年代，肺癌的發病率和死亡率仍然居高不下，在相當長的一段時間內仍然是導致人類因癌癥死亡的首要疾病。植物雌激素具有雌激素激動劑和阻斷劑雙重效應，對乳腺癌、前列腺癌、結腸癌等具有良好而深遠的應用前景，潛力巨大。通過大量細胞、動物水平實驗分析發現，以異黃酮為代表的植物雌激素能較好的抑制腫瘤生成，表現出抑制其轉移、抵制侵襲、抗氧化，誘導腫瘤細胞凋亡[10-11]等多種生物活性作用，在預防和抑制腫瘤上前景遠大。

Fig 4 Effect of Daid on invasion of

*P<0.05vsControl

化療藥物重要的作用機制之一是促進腫瘤細胞凋亡。凋亡是細胞維持體內環境穩定而采取的一種自殺式基因調控行為，到目前為止，引起細胞凋亡共有三種信號轉導途徑：死亡受體信號途徑、線粒體途徑和內質網應激途徑[12]。Caspase-3即為內質網應激途徑中的凋亡執行蛋白酶。本實驗結果顯示，不同劑量Daid作用于H1299及A549兩種肺癌細胞48 h后，細胞的增殖活性被明顯抑制，且隨著Daid濃度的增加而呈濃度依賴性。而凋亡蛋白Cleaved Caspase-3表達的增加，也進一步證實Daid抑制肺癌細胞增殖的作用機制可能與誘導其凋亡有關。

自噬是真核細胞所特有的代謝途徑，作為細胞內大分子物質的一種降解通路，近年來被廣泛關注。機體內環境穩態失衡、受到氧化應激等刺激均可引起細胞自噬發生。細胞啟動自我保護，將待降解的細胞器或胞質蛋白包裝成自噬體，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物，藉此實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新[11]。在惡性腫瘤的發生、發展中，腫瘤細胞常常出現自噬功能的紊亂。控制腫瘤細胞的自噬有可能成為改善腫瘤治療的方向之一[13]。微管相關蛋白輕鏈3(LC3 Ⅱ/Ⅰ)是自噬活性標志物，可反映自噬活性[14]。本研究結果顯示，與對照組相比，Daid可上調A549和H1299細胞自噬相關蛋白LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白的表達，表明Daid有促進肺癌細胞自噬作用。

Fig 5 Effect of Daid on cleaved Caspase-3 and LC3 Ⅱ/Ⅰ protein expression in lung cancer n=3)

*P<0.05,**P<0.01vsControl

綜上所述，本研究證實Daid可抑制人肺癌細胞株A549和H1299的增殖，促進其凋亡，并引起LC3 Ⅱ/Ⅰ等自噬蛋白表達的改變，提示凋亡及自噬可能參與Daid抑制肺癌細胞增殖的過程，但其具體作用機制及自噬是否為誘發細胞凋亡的直接因素等，有待進一步深入研究。