濕潤暴露療法/濕潤燒傷膏對慢性創面組織中MMP-2和 MMP-9表達的影響

陳端凱，馮 時，唐乾利，姜 艷，2，唐 強，岑小寧，黃漢基，尹 星

(1.右江民族醫學院臨床醫學院，廣西 百色 533000；2.廣西大學醫學院，廣西 南寧 530004；3.廣西中醫藥大學第一臨床學院，廣西 南寧 530001)

慢性難愈合創面是指創面皮膚在一個月內無法實現皮膚的完整性，且炎癥反應和組織損傷不斷增加的創面[1]。本病發病率高，常影響患者的生活質量，給其帶來巨大的心理及經濟負擔。目前臨床針對慢性難愈合創面的治療方法各式各樣，但療效均具有局限性。因此，人們都嘗試以濕潤暴露療法/濕潤燒傷膏(moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment，MEBT/MEBO)治療慢性難愈合創面。

徐榮祥教授發明的MEBT/MEBO應用于燒傷創面，主要是將濕潤暴露療法與濕潤燒傷膏的有機結合[2]，且臨床療效明顯。唐乾利教授研究團隊[3-4]將該技術拓展應用于慢性難愈合皮膚潰瘍創面，并進行了一系列臨床與基礎研究，取得了較好的研究成果，但具體作用機制仍然不甚明了，仍待進一步探索。已有研究表明：細胞外基質(ECM)表達的變化在慢性難愈合創面修復方面具有一定的作用效果[5]，而基質金屬蛋白酶(MMPs)可參與ECM的降解與重塑[6]，其中基質金屬蛋白酶2( MMP-2)和基質金屬蛋白酶9( MMP-9)能夠通過降解ECM，進而來參與ECM重塑的調節。但MEBT/MEBO是否通過影響慢性難愈合創面組織中 MMP-2和 MMP-9的表達來促進創面愈合？尚未得到證實。

有鑒于此，本研究將通過構建大鼠慢性難愈合創面模型，觀察大鼠創面組織中 MMP-2和 MMP-9的動態表達，以及MEBT/MEBO的影響效果，進而闡明 MMP-2和 MMP-9在創面修復中的具體作用，并完善MEBT/MEBO的部分作用機制，為臨床推廣提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級Wistar成年大鼠【長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號SCXK(湘)2014.0011】，♂，12周齡，體質量(235±15)g。

1.1.2儀器與試劑 Western blot全套系統(美國BIO-RAD)；超微量紫外分光光度計(德國Backman)；酶標儀(美國賽默飛)；實時熒光定量聚合酶鏈反應儀(美國Roche)；4 ℃離心機(德國Eppendorf)；顯微鏡(日本Olympus)。美寶濕潤燒傷膏(汕頭市美寶制藥有限公司，國藥準字Z20000004)；貝復新(珠海億勝生物制藥有限公司，國藥準字S20040001)；醋酸氫化可的松(上海通用藥業股份有限公司，國藥準字H31021290)； MMP-2和 MMP-9一抗(美國Novus)；二抗(北京索萊寶)； MMP-2、 MMP-9和GAPDH引物(上海生工)；RNA提取、逆轉錄、熒光試劑盒(北京天根)； MMP-2、 MMP-9 ELISA試劑盒(美國R&D公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1動物模型的建立 將90只SPF級♂ Wistar大鼠，適應性喂養1周后，按數字表法隨機分為5組：MEBO組、貝復新組、慢性組、急性組及空白組，每組18只。經10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后，對5組大鼠均進行備皮。除急性組和空白組外，其余3組大鼠均參照付小兵等全層皮膚缺損法和沈氏改良塑料環肉芽腫定量法經改進制成大鼠慢性難愈合創面模型[7-8]。在大鼠靠近脊柱處剪切15 mm圓形全層皮膚開放性創口，隨后敷蓋消毒干紗布，并膠條固定。再對MEBO組、貝復新組和模型組腹腔注射醋酸氫化可的松[8 mg·(100 g)-1]處理，建立成大鼠慢性難愈合創面模型。急性組以同樣的方法進行剪切皮膚包扎處理，但是不注射醋酸氫化可的松。空白組只需進行備皮處理，而沒有做任何創面損傷處理。

1.2.2治療方法 造模成功后，隨后進行早晚各一次的常規消毒和換藥處理，直至取材完成。換藥方法如下：MEBO組在創面均勻涂抹MEBO藥膏(約1.0 mm厚)后，再在傷口敷蓋浸有MEBO藥膏的紗布塊[0.2 g·(cm2)-1]；貝復新組在創面涂抹貝復新[262.5 U·(cm2)-1]后，再在創面敷蓋浸有貝復新的紗布塊[60.0 U·(cm2)-1]；急性組和慢性組只需將浸有生理鹽水的紗布塊敷蓋于創面上。包扎前均加蓋兩層干紗布，膠條“豐”型固定。

1.2.3實驗標本采集 造模后，分別于d 3、14每組各隨機處死9只大鼠，剪取相同部位從深筋膜下層切取距離創緣0.5 cm的整個創面及周圍組織的肉芽組織，一部分儲存于-80 ℃冰箱，待進行蛋白及基因檢測，另一部分則放在10%甲醛中進行固定，待后期行病理切片觀察。

1.3 檢測方法

1.3.1創面愈合情況 于造模d 3、14，對傷口大小進行透明薄膜覆蓋描畫及拍照記錄。并利用Image J軟件對創面進行分析處理，創面愈合率計算公式：創面愈合率/%=[(原始創面面積-殘余創面面積)/原始創面面積]×100%。創面愈合時間則以創面傷口完全上皮化為標準進行計算。

1.3.2HE染色 取創面組織后，進行固定脫水包埋切片等操作。再行常規HE染色，在光學顯微鏡下觀察各組創面組織形態學變化。

1.3.3ELISA MMP-2和MMP-9的檢測方法均按照ELISA試劑盒操作說明書進行操作，檢測各組織勻漿中 MMP-2和 MMP-9蛋白表達情況。

1.3.4Western blot技術 取標本后，提取蛋白，檢測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，轉膜至PVDF膜；室溫搖床封閉1 h；清洗(均用TBST清洗3次，每次6 min，下同)；4 ℃一抗搖床孵育過夜；清洗；室溫二抗孵育1 h；清洗；洗膜結束后進行發光顯影。最后利用Image J軟件進行灰度分析處理。

1.3.5qRT-PCR 按照試劑盒操作說明書進行提取RNA和逆轉錄處理，再以逆轉錄得到的cDNA進行擴增檢測目的mRNA轉錄水平。再將檢測到的CT值，用相對定量2-ΔΔCt法進行分析處理。見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence

2 結果

2.1 MEBO對大鼠大體情況的影響造模d 2，慢性組大鼠死亡2只，補同批次大鼠2只，其他各組均無死亡情況。余下老鼠情況良好，能夠正常自主飲食飲水。

造模d 3，滲液、水腫情況：急性組、MEBO組和貝復新組輕于慢性組；肉芽組織生長情況：急性組、MEBO組和貝復新組可見肉芽組織的存在，而慢性組則較少見。見Fig 1。

Fig 1 General situation of wound healing

A: Acute wound group; B: Chronic wound group;C: rb-bFGF group; D: MEBO group.1: d 3; 2: d 14.

造模d 14，急性組、MEBO組和貝復新組創緣長出毛發，創口干燥，且均長出痂皮；而慢性組創口可見色澤暗紅、壞死、紅腫及滲液滲出。

2.2 MEBO對大鼠創面愈合時間及愈合率的影響急性組、MEBO組和貝復新組創面愈合時間明顯短于慢性組，且差異具有統計學意義(P<0.05)。見Fig 2。

與慢性組相比，造模d 3，急性組創面愈合率增高，且有統計學意義(P<0.05)；MEBO組和貝復新組也增高，但是差異無統計學意義(均P>0.05)；而d 14，創面愈合率均升高，差異有統計學意義(均P<0.05)。見Fig 3。

Fig 2 Wound healing in each

1: Acute wound group; 2: Chronic wound group;3: rb-bFGF group; 4: MEBO group.*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

Fig 3 Wound healing rate in each group

*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

2.3 MEBO對大鼠創面組織形態學變化的影響空白組是正常皮膚，故可見正常的皮膚附件存在，整齊排列的膠原纖維及少量成纖維細胞。

造模d 3，炎性細胞浸潤情況：各組均可見大量炎性細胞的浸潤；間質水腫情況：慢性組間質水腫情況較急性組、MEBO組和貝復新組嚴重；新生毛細血管情況：急性組、MEBO組和貝復新組可見排列紊亂的毛細血管分布，而慢性組稀少。

d 14，炎性細胞浸潤情況：除慢性組外，急性組、MEBO組和貝復新組幾乎不見炎性細胞的浸潤。膠原纖維情況：急性組、MEBO組和貝復新組可見到排列整齊的膠原纖維，而慢性組則排列紊亂；皮膚附件生長情況：除慢性組外，急性組、MEBO組和貝復新組均可見正常皮膚附件生長。見Fig 4。

Fig 4 Changes of wound tissue morphology of rats in each group at each time point(HE,×200)

A: Acute wound group; B: Chronic wound group; C: rb-bFGF group; D: MEBO group; E: Blank group.1: d 3; 2: d 14

2.4 MEBO對大鼠創面組織勻漿中 MMP-2和 MMP-9表達的影響通過ELISA檢測結果發現:空白組MMP-2和 MMP-9低表達。與慢性組比較，d 3創面組織中，急性組、MEBO組和貝復新組均增高，且有統計學意義(P<0.05)；而d 14，急性組、MEBO組和貝復新組MMP-2和MMP-9表達也均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，(見Fig 5，6)。

2.5 MEBO對大鼠創面組織中 MMP-2和 MMP-9蛋白表達情況的影響空白組幾乎不表達 MMP-2和MMP-9。與慢性組相比，d 3創面組織中，急性組、MEBO組和貝復新組中 MMP-2和 MMP-9的蛋白表達量增高(均P<0.05)；d 14，急性組、MEBO組和貝復新組中 MMP-2和 MMP-9的蛋白表達量均降低(均P<0.05)，(見Fig 7，8)。

Fig 5 Protein expression of MMP-2 in homogenate

1: Acute wound group; 2: Chronic wound group; 3: rb-bFGF group; 4: MEBO group; 5: Blank group.*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

Fig 6 Protein expression of MMP-9 in homogenate

1: Acute wound group; 2: Chronic wound group; 3: rb-bFGF group; 4: MEBO group; 5: Blank group.*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

2.6 MEBO對大鼠創面組織中 MMP-2和 MMP-9 mRNA轉錄水平的影響空白組幾乎不轉錄 MMP-2 mRNA和 MMP-9 mRNA。與慢性組相比，d 3創面組織中，急性組、MEBO組和貝復新組中 MMP-2 mRNA和 MMP-9 mRNA轉錄水平均增高，差異有統計學意義(均P<0.05)；在d 14，急性組、MEBO組和貝復新組中 MMP-2 mRNA和 MMP-9 mRNA轉錄水平均降低，差異均具有統計學意義(均P<0.05)，(見Fig 9，10)。

Fig 7 Protein expression of MMP-2

1: Acute wound group; 2: Chronic wound group; 3: rb-bFGF group; 4: MEBO group; 5: Blank group.*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

Fig 8 Protein expression of MMP-9

1: Acute wound group; 2: Chronic wound group; 3: rb-bFGF group;4: MEBO group; 5: Blank group.*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

3 討論

慢性難愈合創面快速增長的發病率正在威脅著臨床醫生，其不愈合傷口的增長速度遠遠快于有效新療法的出現，故尋求有效治療慢性難愈合創面的新方法迫在眉睫。本研究通過探討MEBT/MEBO對慢性難愈合創面組織中 MMP-2和 MMP-9表達的影響，并進一步探討MEBT/MEBO可能作用機制，為臨床治療慢性難愈合創面提供理論依據。

Fig 9 mRNA expression of MMP-2 in each

1: Acute wound group; 2: Chronic wound group; 3: rb-bFGF group; 4: MEBO group; 5: Blank group.*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

Fig 10 mRNA expression of MMP-9 in each

1: Acute wound group; 2: Chronic wound group; 3: rb-bFGF group; 4: MEBO group; 5: Blank group.*P<0.05vsAcute wound group;#P<0.05vsChronic wound group.

MMP-2和 MMP-9具有降解ECM蛋白并激活細胞因子、趨化因子的功能，故常參與皮膚傷口愈合的過程，如炎癥，基質重塑和上皮的形成。而ECM是廣泛的分布于各細胞之間，參與關鍵細胞的調節作用，如細胞的黏附、遷移、增殖、分化和存活。在正常生理情況下，ECM的穩態平衡是確保正常器官發育和組織穩態的關鍵，而 MMP-2和 MMP-9參與這一穩態平衡的維持。已有多項研究證明，當出現基質異常沉積時， MMP-2和 MMP-9的表達量就會升高，以降解ECM的含量，來保證穩態的平衡[5,6,9-11]。因此， MMP-2和 MMP-9在創面愈合中作用不容小覷。

本研究結果顯示，急性組中 MMP-2和 MMP-9的表達呈先升高后降低的趨勢，而慢性組中 MMP-2和 MMP-9表達的升高呈明顯的時間依賴性，然而在d 14慢性組表達明顯高于急性組。在正常皮膚中能夠少量表達 MMP-2，而幾乎不表達 MMP-9。慢性創口在早期炎癥階段狀態下，就出現了修復的停滯；而急性組能夠進行正常修復的主要原因是由于它能夠及時的通過炎癥階段這一進程，進入增殖與重塑階段。此次實驗通過建立大鼠創面模型，發現了慢性創面與急性創面的愈合差異可能與 MMP-2和 MMP-9表達變化相關。既往研究結果發現，急性創面早期 MMP-2和 MMP-9表達升高，但是后期將恢復到基礎水平；而在炎癥持續的情況下，慢性創面組織中的 MMP-2和 MMP-9表達持續上升并在后期高于急性創面組織的表達，進而導致創面發生延遲愈合。本研究結果與既往發現相契合[12-13]。

同時，在研究過程中發現：MEBO組和貝復新組中 MMP-2和 MMP-9的表達與慢性組之間的差異是隨時間的變化發生改變的；在創傷的早期，MEBO組和貝復新組中的 MMP-2和 MMP-9的表達量是高于慢性組的，而后期則低于慢性組的表達，且我們通過創面愈合率與創面愈合時間的結果分析發現，MEBO組和貝復新組的創面愈合情況較慢性組好，提示：MEBO組和貝復新組可能通過調控 MMP-2和 MMP-9的表達來促進創面愈合的。

創面愈合的關鍵在于血管新生為創面提供足夠的營養物質[14]。血管新生的關鍵在于血管發生側支生芽，而生芽的關鍵在于血管基底膜的降解， MMP-2和 MMP-9在其中發揮著重要的作用，本研究HE染色結果發現，早期高表達 MMP-2和 MMP-9的急性組、MEBO組和貝復新組能夠觀察到大量的毛細血管新生，提示MMP-2和 MMP-9促進創面愈合可能是通過降解ECM，進而促進血管新生。這與既往研究結果一致，MMP-2和 MMP-9能夠降解ECM，調節著ECM的穩態平衡，進而促進創面的愈合[9,15]。

綜上，本研究結果表明 ，MMP-2和MMP-9與創面愈合結局密切相關，MEBT/MEBO可能通過調控慢性難愈合創面組織中 MMP-2和 MMP-9表達來影響創面的愈合，這為臨床治療慢性難愈合創面提供了更價廉、效優的治療方法。全面了解 MMP-2和 MMP-9的調節，對創面修復和患者預后有著重要的作用，我們在研究中雖證實MEBT/MEBO能夠調控慢性創面組織中 MMP-2和 MMP-9的表達，但是MEBT/MEBO是否可通過調控 MMP-2和 MMP-9來影響慢性創面組織中ECM表達尚屬未知，故仍需進行體內外 MMP-2和 MMP-9基因位點敲除實驗，進一步闡述其具體機制。